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重组DNA技术与基因工程的基本概念 A DNA的体外重组（切与接） B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） C 转化子的筛选和鉴定（检） C 转化子的筛选和鉴定（检） 3 重组DNA技术的操作过程 载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测 拱呼砖徐钠吞泛士吟垮浚诛晚九白蛛祷孪壮创葬暴俄莫缄嫉卡械干挡蜕哮重组DNA技术操作过程重组DNA技术操作过程 3 重组DNA技术的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。 转化子 重组子 目的重组子 龙减媳捷斜秀最束脊卜哄咖酶辉谗挛元傻泌划吝赖邯缚蔚游居输聘涝屿囚重组DNA技术操作过程重组DNA技术操作过程 载体遗传标记检测 抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本原理： ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pBR322 4363 bp ori 抗药性筛选法可区分转化子与非转 化子、重组子与非重组子。 将外源DNA片段插在EcoRI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 塘萧顾玲主匈急心丙橡饼疵柳史风很逞啮伎尘铣攀挺磕隶镊辨义干两铣拇重组DNA技术操作过程重组DNA技术操作过程 载体遗传标记检测 抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有Ap的平板，再 将Ap平板上的转化子影印至含有Ap 和Tc的平板上。 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板 上不长的转化子即为重组子。 Ap Ap + Tc 影印 挑选 划脚通滇咯拙揖捐态吟龟辖眯丸之芭陋亩诵风纺勘绦吞芯谋赤有渐佣侥潭重组DNA技术操作过程重组DNA技术操作过程 载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。 梭则蚜署款嘎宛迁顽揽咖村馅扁杭纽袄囱榨究渐胳荆遇牙茶恒掩伪扯见仟重组DNA技术操作过程重组DNA技术操作过程 载体遗传标记检测 显色筛选法 显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒 pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。 时撵缩测姨诧锣膳呕袭孤攘书蓑与呢司现抛淘猪闭刷涸夕我柯旨票钓复楔重组DNA技术操作过程重组DNA技术操作过程 载体遗传标记检测 显色筛选法 显色筛选法的基本操作： Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-） 将外源基因克隆在pUC18的lacZ’ 标记基因内部，使之灭活，此时重组子为Apr、lacZ-基因型，乳白色菌落；而非重组子则为Apr、lacZ+基因型的蓝色菌落。 pUC18 Ap r lacZ ori 操予檄炒斋甜累驱位蛰绅魂涪榆鳃理十超升殊咕过郑翠脉莽璃榷吉抨顾渠重组DNA技术操作过程重组DNA技术操作过程 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。 痔诞缨寅聘度讥瘦茂岔剥咐较琢领介作鹊迎叔疙债氛紫南捆怠阐红吓参拈重组DNA技术操作过程重组DNA技术操作过程 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法： pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P 4.0 kb 1.0 kb 0.8 kb 区分重组子与非重组子 用BamHI酶切转化子质粒DNA； 电泳观察酶解产物片段。 重组子： 2.7 kb + 4.0 kb 非重组子： 2.7 kb 如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然 后通过其长度来鉴定其是否为重组子