茶树咖啡碱合成途径中疑似N-甲基核苷水解酶的原核表达及活性验证.pdfVIP

目 录 摘 要I Abstract II 1 文献综述 1 1.1 咖啡碱的生理功能 1 1.2 低咖啡碱茶饮的研究进展 2 1.3 茶树体内咖啡碱合成途径研究 3 1.3.1 咖啡碱合成途径研究 3 1.3.2 茶树咖啡碱合成途径中相关酶的研究 4 1.3.3 天然低咖啡碱茶树品种基因研究 4 2 引 言 6 2.1 研究意义 6 2.2 技术路线 6 2.2.1 N- 甲基核苷水解酶基因的克隆及表达 6 2.2.2 表达蛋白的活性验证 7 2.3 研究内容 8 3 材料与方法 9 3.1 材料 9 3.2 仪器与试剂 9 3.2.1 主要仪器设备 9 3.2.2 主要试剂盒 9 3.2.3 主要试剂配方 10 3.3 方法 11 3.3.1 茶树中候选7- 甲基黄嘌呤核苷水解酶基因的克隆 11 3.3.2 茶树候选N- 甲基核苷水解酶（STx ）在大肠杆菌中的表达 11 3.3.3 表达蛋白的活性分析 16 3.3.4 7-MXR 的试制备 18 4 结果与分析 19 4.1N- 甲基核苷水解酶在大肠杆菌中的表达 19 4.2 STx 酶的体外酶活性检测 20 4.2.1 以XR 为底物的体外酶活性检测结果 20 4.2.2 混合CaXMT 酶的体外酶活性检测结果 21 III 4.3 STx 酶的体内酶活性检测 22 4.3.1 以XR 为底物的体内酶活性检测结果 22 4.3.2 混合CaXMT 酶的体内酶活性检测结果 23 4.4 7-MXR 的试制备 24 5 结论与讨论 26 5.1 结论 26 5.2 讨论 26 参考文献 29 附录A. 英文缩写及注释 32 附录B. 茶树候选核苷酶STx 及内参基因的核苷酸序列 34 致 谢 37 作者简介 38 IV 1 文献综述 1.1 咖啡碱的生理功能 咖啡碱（Caffeine，1，3，7- 甲基黄嘌呤）是一种小分子的嘌呤碱。咖啡碱 在植物中广泛存在，目前已知，在全世界范围内，至少有60 多种植物中含有咖 [1] 啡碱 ，其中世界三大饮料性植物里，茶(Camellia sinensis)含有2%-5%、咖啡豆 （Coffea arabica）含有1%-2% 、可可（Theabronma capana）含有4% 以下。在茶 树体内的生物碱中含量最高的既是咖啡碱，而可可碱、茶叶碱含量均远低于咖啡 碱，分别为0.005%和0.002%[2] 。 咖啡碱是一种重要的植物次级代谢产物，存在于植物的各部分组织中，如嫩 [3-5] 叶、幼嫩茎、花和果实等，主要起到抗菌、杀虫等抵御外界入侵的作用 。 咖啡碱不仅在植物体中具有重要的生理功能，对动物特别是人体而言，也具 有多种生理功效。咖啡碱是一种中枢神经兴奋剂，适量服用能够刺激神经系统、 [6-9] [10] 增强记忆力 ，刺激呼吸系统、增加换气量和膈肌活力 ，还能促进胰岛素分 泌，增加胃酸分泌等[11-12]，因此广泛应用于医疗、制药、饮食等领域。 由于具有多种生理功效，咖啡碱是世界上消费最广泛的精神类药物和饮食摄 [13] 入