黄立平猪圆环病毒2型检测技术.pptVIP

敬请各位批评指正！ 谢谢！ 各位专家老师参会代表下午好，我是哈兽研的刘长明研究员实验室的黄立平，很荣幸大会给我这次机会与大家分享我们实验室的PCV2检测技术。 首先，我们回顾一下圆环病毒2型(PCV2)的基本特性。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属成员，它是一种无囊莫20面体对称的病毒，其直径只有17nm。PCV2的基因组也非常的节俭，仅含有1766-1769个碱基，主要包括3个ORF，其中ORF1编码病毒的复制酶相关蛋白，ORF2编码病毒的cap蛋白，60个Cap与基因组共同组装成为完整的病毒粒子。由于Cap是惟一的结构蛋白，所以成为疫苗和诊断试剂研究的靶抗原。 PCV2虽然小，但是其致病性比较复杂，常与多种病原混合感染，与断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎肾炎综合征、呼吸道综合之呢过和繁殖障碍有个千丝万屡的关系，给养殖业带来巨大的经济损失。 目前减少这种经济损失最有效的方法是疫苗免疫，市场上PCV2疫苗品种繁多，其中哈兽研维科公式生产的PCV2(LG株)灭活疫苗是刘长明研究员研制的疫苗，我们的疫苗有一系列配套检测试剂盒支持，确保其产品质量。 PCV2疫苗是否有效，以下两个方面比较关键：一是疫苗的免疫效力；二是疫苗的抗原含量；我们先介绍第一部分 们通过优化竞争ELISA的反应程序，进而确定了该方法的检测临界值。由于该方法中的单抗具有中和活性，所以我们思考该ELISA检测到的抗体水平是否能够反映中和抗体水平，于是我们针对这个问题设计了几个实验。 第一个实验是以SNA为标准评价竞争ELISA的敏感性和特异性，研究结果如表所示，竞争ELISA的检测敏感性为98.5%，特异性为88.5%。 在第二个实验中我们利用中和试验、IPMA和竞争ELISA平行检测24分不同抗体效价的血清样品，结果发现SNA和竞争ELISA检测结果的相关性系数要高于SNA和IPMA的相关性系数，由此可以推测，竞争ELISA的检测结果更能反映PCV2的中和抗体水平 接下来，我们选取了3个国产试剂盒和一个进口试剂盒与我们研制的竞争ELISA进行比较 结果显示，竞争elisa与进口试剂盒E检测敏感性和特异性均优于其他三种试剂盒。我们又采用不同效价的血清样品分析差异的原因，结果发现：当抗体效价高于800时，5种试剂盒的检测一致性均高于90%；而当抗体效价低于400倍时，竞争ELISA和进口试剂盒要优于其他三种试剂盒。 结果显示，竞争elisa与进口试剂盒E检测敏感性和特异性均优于其他三种试剂盒。我们又采用不同效价的血清样品分析差异的原因，结果发现：当抗体效价高于800时，哲种试剂盒的检测一致性高于90%；二当抗体效价低于400倍时，竞争ELISA和进口试剂盒要优于其他三种试剂盒。 既然竞争ELISA与IPMA检测结果具有良好的一致性，所以我们试图用竞争ELISA代替IPMA评价疫苗的免疫效力，结果显示，一免后2周免疫组猪开始抗体阳转，二免之后免疫组全部阳转；攻毒组感染后2周抗体开始阳转，由此可见竞争ELISA的检测结果与IPMA一致，因此可以替代IPMA. 熟悉PCV2的都知道现地猪的血清阳性率很高，那么为什么还会受到PCV2感染的影响呢？于是我们利用竞争ELISA检测不同年龄段PCV2血清抗体水平，结果如图所示，在4周龄之内和16周龄之后抗体阳性率很高，恰恰在断奶后1个多月的时间内抗体阳性率很低，这个结果与断奶后仔猪多系统衰竭综合征的发病期刚好吻合，该结果提示我们在断奶之前需要进行疫苗免疫。 目前竞争ELISA试剂盒的表存期实验已经完成，4摄氏度可以稳定保存12个月。该方法已经发表，我们正在撰写材料准备申报临床实验。 关系到疫苗质量的第二个问题是抗原含量，目前测定抗原含量的方法主要包括定量PCR，毒价测定和捕获ELISA.我们实验室是用毒价测定的方法，由于该方法操作繁琐费时，所以建立了一种抗原捕获的方法定量PCV2. 该方法首先用多抗包被ELISA板，然后捕获样品中的PCV2，之后以HRP标记的单抗作为检测抗体。 系统优化之后，确定捕获ELISA的临界值。 猪圆环病毒2型检测技术 报告人：黄立平 博士 哈尔滨兽医研究所 2014-4-29 兽医生物技术及兽医免疫的进展与应用—猪病论坛 PCV2简介---PCV2的形态及其基因组 无囊膜，20面体对称，17nm nt PCV2简介---Cap蛋白的结构 PCV2简介---PCV2的致病性 （PMWS） （PDNS） （PRDC） （RF） PCV2相关疾病的防控 免疫效力：特异性抗体/检测方法 抗原含量：检测方法/毒价测