第七章重组体克隆筛选和鉴定.pptVIP

三、酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理： 一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 19 2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 孔底 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 （2）一抗结合 一抗 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。 （3）二抗结合 二抗 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。 （4）显色反应 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 （5）比色 3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody） 临床检验常用的单抗 四、免疫印迹（western blotting）法 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理： 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 Blotting 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物， 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶：HRPO 1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 Blotting过程 第六节 DNA的序列分析 已讲，不多做解释 * * 第七章 重组体克隆的筛选和鉴定 一、抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。 第一节 载体表型选择法 1. 原理： pBR322 （1）四环素： （2）氨苄青霉素抗性基因： 2. pBR322抗菌素标记选择 产生?-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。 （3）环丝氨酸： 3. 选择过程： 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。 （1）四环素抗性插入失活 无环丝氨酸培养基 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。 二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法 ?-半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖 葡萄糖 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 + + 深蓝色 1. 原理： 载体上有一段?-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的?片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的?-半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的?-半乳糖苷酶。 假阴性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏?肽）。 2. 选择过程 ?-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。 转化进来的外源基