骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系.docVIP

　　骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体在成骨过程中与血管内皮细胞生长因子关系 作者：韩冬，李建军，孙鸿斌，李春雨，王悦书 【摘要】 ［目的］探讨骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体（A rebinant adenoviral vector carrying the human BMP2 gene,AdBMP2）在成骨过程中和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial groarro cells,BMSC），感染后观察BMP2、VEGF和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达及钙结节形成。同时将30 μl AdBMP2行裸鼠左后肢肌组织内注射，术后20 d取材，免疫组化和原位杂交法观察BMP2与VEGF体内表达情况。30 μl β半乳糖苷酶腺病毒载体（Ad β gal）右后肢肌内注射作为对照。［结果］BMSC被AdBMP2感染后，向成骨细胞分化，上调VEGF的表达。在体内成骨过程中，BMP2在软骨细胞、成骨细胞和再生骨组织周围单核细胞表达阳性，VEGF在软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞均表达阳性。［结论］BMP2和VEGF两者协调一致，互为促进，完成了骨组织的发生。 【关键词】 腺病毒; 骨形态发生蛋白; 血管内皮细胞生长因子; 基因 　　VEGF是主要促进血管再生的生长因子，在软骨化骨的再生过程中，发挥着重要的作用，BMP2是 目前 成骨活性明确的诱导因子。但是，由AdBMP2引起的骨组织再生过程中，VEGF所起的作用以及VEGF和BMP2两者间的相互关系却知之甚少。本 研究 将hBMP2基因导入到兔BMSC， 分析 基因感染后BMP2对细胞分化和VEGF表达的 影响 。同时，又将AdBMP2直接注射到裸鼠肌组织内，探讨VEGF在AdBMP2启动的骨组织再生过程中所起的作用及VEGF和BMP2两者间的相互关系，为进一步应用基因技术构建血管化的组织工程骨奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 腺病毒载体和细胞株 　　人骨形态发生蛋白腺病毒表达载体（AdBMP2）为E1、E3区缺失的5型重组腺病毒载体，由美国哈佛医学院分子骨科中心Oliver博士馈赠。携带β半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（Ad β gal）和人胚肾细胞株（293细胞）由吉林大学白求恩基础医学院病理教研室高航博士馈赠。 　　1.1.2 主要试剂 　　DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone）。BMP2和VEGF多克隆抗体和原位杂交检测试剂盒（博士德公司）。Xgal（大连宝生物）。ALP试剂盒（上海虹桥医用试剂研究所）。 　　1.1.3 实验动物 　　BALB/c裸鼠（20～25 g，雌雄不限， 中国 医学 科学 院动物所）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 AdBMP2重组腺病毒表达载体扩增、纯化 　　将AdBMP2感染293细胞，待细胞完全出现病变（CPE）后，反复冻融3次，收集溶解产物和细胞，4 ℃ 12 000 r/min×10 min离心取上清收获病毒。氯化铯密度梯度离心法纯化，空斑形成单位测定病毒滴度（PFU）。-70 ℃保存备用。 　　1.2.2 兔BMSC的培养 　　健康日本大耳白兔，（2.0±0.5）kg，3％戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔麻醉。骨髓穿刺针接10 ml注射器，内含稀释的肝素钠2 500U/ml约0.5 ml，从胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液2～3 ml，2 ml PBS混匀，注入含有4 ml淋巴细胞分层液的试管内，密度梯度离心，1 500 r/min离心15 min，吸取中间单核细胞层，PBS洗2次，以2×104 /cm2的密度接种于50 ml培养瓶内，加含10%胎牛血清DMEM培养液5 ml。在5%CO2孵箱内37 ℃培养4 d，更换培养液时将未贴壁的细胞全部弃掉,继续培养且每周换液2次。12～14 d后基本长满单层,用0.25%胰酶消化，以1×104 /cm2的密度传代培养。 　　1.2.3 AdBMP2感染BMSC 　　BMSC按1×104/孔的密度接种于24孔培养板，待细胞长至近60%融合时，更换为2%胎牛血清DMEM培养液，根据计数的细胞数加入AdBMP2（MOI为100），过夜，次日晨更换5%胎牛血清DMEM培养液继续培养。Ad β gal同等条件下感染检测感染效率。 　　1.2.4 AdBMP2裸鼠体内注射 　　使用2％戊巴比妥钠0.1 ml/只麻醉。双后肢消毒后，微量注射器抽取30 μl AdBMP2（6×108病毒颗粒）于4只裸鼠左后肢近膝关节肌组织内处注射，再抽取30 μl A