何水林版基因工程第五章__基因的转移与重组体的筛选和鉴定.pptVIP

?-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。 * 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 二、根据插入基因的表型选择 1. 弥补缺陷 his- his+ 受体菌： 外源基因： 在不含组氨酸的培养基中生长 * 例：抗生素抗性 抗性基因 载体 外源DNA 连接 转化 受体菌 抗生素培养基平板 含抗生素抗性基因的 克隆才能生长 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 2. 增加新性状 * 有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 1. 直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。 三、 DNA电泳检测法 Marker 载体 重组克隆 * 2. 酶切电泳筛选法 根据外源DNA序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：DNA带数和长度。 一般用重组时的内切酶将外源DNA切出 单 双 * * 四、PCR扩增检测法 应用PCR反应扩增出预期DNA片断 （1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）； （2）用外源DNA插入片断引物作PCR； （3）凝胶电泳； （4）是否有条带产生，条带大小是否正确。 * 五、核酸杂交检测法 1. Southern blotting 从宿主细胞中提取DNA，用探针杂交。 * 2. Northern blotting 主要检测插入片断是否被转录。 从宿主细胞中提取RNA，用探针杂交。 * 3. Western blotting 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 ①（SDS） 点样 电泳方向 * 膜 胶 蛋白 ② 转膜 ③ 杂交 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 ④ 检测 3. Western blotting * 4. 原位杂交筛选 * 利用抗体作为“探针”，检测产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。 六、免疫化学检测法 对表达产物的检测。蛋白－蛋白“杂交” 放射性抗体检测 与菌落杂交相似 * DNA测序是最为准确的重组子鉴定方法，可以鉴定重组克隆序列是否准确无误。 七、DNA序列分析 * （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （Luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 植物转化体报告基因（reporter gene)筛选 报告基因：基因载体上引入的一些可证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。 * （1）获得目的基因； （2）目的基因与载体的酶切与连接； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）转化受体细胞的大量繁殖； （5）目的基因的检测和表达。 进行基因工程操作的一般步骤 ? * 1、什么是感受态细胞？简述CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理 ？ 2、什么是Ti质粒？简述农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法。 3、重组子筛选主要有哪些方法 ？ 思 考 题 * 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 先将实验植物材料，例如矮牵牛的叶片进行表面无菌消毒，用经过消