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实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践 　　1993 年，Higuchi 等人将PCR 技术和封闭式检测相结合，对目的核酸数量进行定量分析，提出了荧光定量PCR 技术的概念。1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，达到定量核酸的目的，自此Real-Time PCR 技术才得以真正的推广和应用。到目前为止，实时荧光定量已被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等科学领域。 　　1 原理 　　Real-Time PCR 是在PCR 反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号对整个PCR 进程进行实时监测，从而达到对未知起始模板进行定量分析的目的。它是一种将酶动力学、核酸扩增、光谱分析和实时检测技术相结合的技术。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号，这样就可以通过荧光信号强度变化实时监测PCR 产物量的变化，从而得到一条描述PCR 动态进程的曲线，即扩增曲线。 　　实 时荧光定量PCR 扩增曲线可以分为4 个阶段: 基线期、早期指数期、对数-线性期和平台期，见图1。在基线期( 通常1 ～ 15 个循环) ，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化; 早期指数期，荧光信号超过背景信号并到达阈值( 通常为基线信号标准偏差的10 倍) ，此时循环数称为Ct( Cycle threshold) 值或Cp( Crossingpoint) 值，Ct值与模板起始浓度的对数值成反比线性关系，因而Ct值可被用来定量模板起始浓度; 对数-线性期，在理想反应条件下每经历一个循环，PCR 产物加倍; 平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始模板拷贝数。实时荧光定量PCR 能准确地确定初始模板拷贝数，结果重现性好，误差小，与常规PCR 在终点定量上相比更具重要意义。实时荧光定量PCR 结果不仅可以定性( 判断一段序列的存在与否) ，还可定量( 确定基因的拷贝数) ，而常规PCR 只能做到半定量。另外，实时荧光定量PCR 的反应和检测都是在封闭的反应管中进行的，样品污染几率大大降低，无需扩增后的实验操作，大大节省了实验时间，提高了实验效率。 　　2 Real-Time PCR 定量类型 　　实时荧光定量分析包括绝对定量和相对定量。绝对定量是对未知样品绝对拷贝数进行测定的方法;相对定量不是测定样品的绝对拷贝数，而是比较样品之间同一目的基因的相对表达量，以期分析样品之间目的基因的表达差异。 　　2. 1 绝对定量 　　绝对定量是使用一系列已知浓度( 通常为5 ～ 6个梯度稀释的浓度) 的标准品绘制标准曲线，建立Ct值与起始模板量[总核糖核酸( RNA) 或脱氧核糖核酸( DNA) ] 的对数值之间的线性关系，达到对未知样品绝对的定量。标准曲线的绘制首先是标准品的选择，标准品可以是DNA( 重组质粒DNA、基因组DNA、纯化的RT-PCR 产物及合成的寡核苷酸DNA) 或RNA( 体外转录RNA[5，8-10]) 。但是为了保持与待测样品间扩增效率的一致性，标准品应尽量选择与待测样品结构近似的样品，该方法要求梯度稀释的标准品都必须与待测样品同时平行扩增，且待测样品浓度应包含在已知标准品浓度范围之内。 　　2. 2 相对定量 　　相对定量解析方法相对复杂，一般用于基因表达分析。根据选用的标准不同可分为以质量单位为标准的相对定量和以内参基因为标准的相对定量。以质量单位( 细胞的数目或核酸的微克数) 作为标准的相对定量优点是实验设计概念简单，数据分析处理简单易学，缺点是很难准确量化初始材料; 而以内参基因作为标准的相对定量优点是能准确量化初始材料的载量，尤其当初始材料受限时，进行相对表达分析十分方便。缺点是要求得到一个或多个在所有待测样本中恒定表达的内参基因。目前，使用较多的是以内参基因作为标准的定量方法。 　　2. 2. 1 内参基因的稳定性评价为了确保定量结果的可靠性和准确性，在qRT-PCR 中需选择合适的内参基因对不同样品之间因质量、RNA 的提取效率以及反转录效率不同所产生的差异进行校正，从而实现对不同样品中RNA 的定量和数据归一化。理想的内参基因应满足以下条件: 1) 在不同发育阶段和不同组织器官中表达稳定; 2) 表达不受生物学、实验条件的影响; 3) 其稳定的表达水平与目的基因表达水平相近。在植物qRT-PCR 研究中用的最多的内参基因通常是看家基因( housekeepinggenes) ，然而越来越多的研究