姜黄素对结肠癌细胞株NKD2 及CXCR4基因表达影响的讨论.docVIP

姜黄素对结肠癌细胞株NKD2 及CXCR4基因表达影响的讨论 　　随着人们生活方式和饮食结构及习惯的改变， 结肠癌的发生率不断升高。结肠癌作为消化道常见的恶性肿瘤，严重危害着人们的健康。肿瘤转移作为结肠癌恶化的特征之一， 也是结肠癌患者死亡的主要原因。因此，如何有效地抑制结肠癌的转移是临床面临的主要难题。同时，研究发现肿瘤的侵袭转移与趋化因子密切相关。CXCR4 作为趋化因子CXCL12的惟一受体，参与多种病理和生理的过程。目前研究表明，CXCL12/CXCR4 构成的生物轴介导恶性肿瘤浸润转移中起着非常重要的作用。CXCR4作为肿瘤细胞中最常见的趋化因子受体，在胃癌、结肠癌、软组织肉瘤等多种肿瘤细胞中表达均明显增加。 　　姜黄素(Curcumin，Cur) 是从姜科植物CurcumaLonga 的根茎姜黄中提取的一种植物多酚类物质，具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗衰老、消除自由基等作用。近年来，国内外对于姜黄素的抗肿瘤作用及其机制做了大量的研究， 发现姜黄素对多种肿瘤的侵袭转移具有明显的抑制效果。有研究报道姜黄素能显著性降低beta;-catenin 基因表达水平，从而抑制Wnt 信号通路，起到抗肿瘤的作用。目前有研究发现NKD2 作为Wnt 通路的抑制因子，具有调控Wnt 信号通路的作用。因此，本实验以姜黄素作为干预药物，通过体外内实验，分别检测结肠癌SW620 细胞及肿瘤组织内NKD2 和CXCR4 的表达水平情况，来探讨姜黄素的抑瘤作用及其机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　抗体NKD2(购自NOVUS 公司)，CXCR4(购自Thermo 公司)，beta;-actin(购自BD 公司)，姜黄素(购自Sigma 公司)。NKD2 siRNA 由上海吉玛制药技术有限公司合成(NKD2-homo-962 序列，正义链：5prime;-CAGAUACACAUGCCGUACATT-3prime; ， 反义链：5prime;-UGUACGGCAUGUGUAUCUGTT-3prime;;NKD2-homo-480 序列，正义链：5prime;-CACGCUCUAUGACUUUGACTT-3prime;，反义链：5prime;-GUCAAAGUCAUAGAGCGUGTT-3prime;)。NKD2引物和CXCR4 引物由上海铂尚生物合成(NKD2 引物， 上游引物：5prime;-ATGCCTCGGTCAACCACTCC-3prime;，下游引物：5prime;-TCTGCCAGTTCACCCTCCATC-3 prime;，其产物长度为151bp;CXCR4 引物， 上游引物：5prime; -CCGTGGCAAACTGGTACTTT-3prime;，下游引物：5prime;-GACGCCAACATAGACCACCT-3prime;，其产物长度为188bp)。人类结肠癌细胞株SW620 来自浙江省重点实验室，所需的相关仪器和设备由浙江大学邵逸夫实验室提供。 　　1.2 动物 　　实验动物为BALB/c 裸鼠8 只，3~4 周龄， 体重15~18g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，SPF实验室饲养， 实验动物使用许可证号SCXK (沪)2008-0016。由浙江中医药大学实验动物中心饲养，饲养温度20plusmn;2℃，适应环境5d，适应期间所有动物均自由摄食和饮水。 　　1.3 药物 　　姜黄素用DMA∶EL∶NS 以1∶4∶15 的比例配置成浓度为100mg/kg 的悬液; 对照组为DMA∶EL∶NS 以1∶4∶15 的比例配置液体;4℃冰箱保存， 临用前室温放置40min，防止颗粒析出。 　　1.4 方法 　　1.4.1 细胞培养和转染 　　人类SW620 结肠癌细胞在37℃和5%CO2条件下， 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基培养。细胞存活率大于80%， 使用0.025%胰蛋白酶(EDTA)消化3~5min，以1∶3~1∶4 的比例传代。实验所用细胞均处于对数生长期。当细胞密度达到30%~50%左右时， 按照Lipo 2000 转染试剂盒说明书使siRNA 转入到细胞内，培养细胞48h，丢弃原先的培养液，再进行其他实验，最后提取细胞蛋白或RNA。 　　1.4.2 Western blot 检测蛋白变化 　　通过Western blot 检测各组细胞内beta;-actin、NKD2 和CXCR4 蛋白的表达量。用不同浓度姜黄素(0、10、20、40mu;mol/L)处理细胞24h，提取各组细胞总蛋白。姜黄素处理NKD2 siRNA 转染后72h 的SW620 细胞24h，提取各组细胞总蛋白。BCA 检测试剂盒测定各组细胞的蛋白浓