原位逆行灌注兔肾 IRI 模型的建立及术后肾功能与组织结构的探究.docVIP

原位逆行灌注兔肾 IRI 模型的建立及术后肾功能与组织结构的探究 原位逆行灌注法对引起肾脏缺血再灌注损伤的保护已有报道，但功能及结构的动态变化还未见报道，本实验旨在建立一个稳定的原位逆行灌注兔肾引起缺血再灌注损伤的模型，并观察不同时间内生化及病理方面的改变，为临床试验提供新的思路。 1 材料与方法 1.1 实验动物和分组 选用 20 只健康成年雄性新西兰大白兔 ( 昆明医学院实验动物中心提供)，体质量2.2~2.5 Kg，实验前温度（22plusmn;2）℃，相对湿度为（55plusmn;2）%，环境中适应性饲养一周，术前晚8 h 禁食，不禁水。分组：随机分成 2 组，每组 10 只，对照组 : 顺行灌注组，即灌注时从肾动脉灌入灌注液，从肾静脉流出的方法灌洗肾脏；实验组：逆行灌注组，即灌注时从肾静脉灌入灌注液，从肾动脉流出的方法灌洗肾脏。 1.2 手术方法 2 % 戊巴比妥自耳缘静脉注射 ( 按 1.0 mL/ kg 体重 ) 麻醉，取腹正中切口，游离右肾至肾蒂，在右肾蒂处留置一根2-0 号丝线不打结，对照组分离左肾动脉长约 2 cm，左肾静脉分离至下腔静脉处，仔细分离从左肾静脉处向上发出的腰背静脉，长约 1.5 cm，远端打结，近端靠近肾静脉处留置5-0 号丝线不打结，用无创血管夹分别在肾动、静脉靠近下腔静脉处夹闭血管，并记录时间，在腰背静脉剪一小口作为灌注液的出口。显微剪刀在夹闭肾动脉侧处剪一小口，用24 G 密闭式静脉留置针，拔取针芯 , 外接一次性的静脉输液器插入小口内并固定，用 0~4 ℃高渗枸橼酸盐嘌呤溶液(HC-A) 肾灌注液 ( 上海长征医院制 ) 匀速灌注，压力为 100cmH2O，灌注至肾脏颜色变白，腰背静脉流出液清澈后停止灌注，9-0 无损伤缝合线连续缝合小口并确定无漏血及血管通畅，左腰背静脉近端靠近肾静脉处留置的 5-0 丝线打结，观察没有活动性出血，临时关闭腹腔，开放左肾动、静脉循环前收紧留置在右肾蒂处的丝线，向下分离右输尿管并结扎，切除右肾。60 min 时开放左肾动、静脉，见肾脏颜色由紫黑变为粉红后关闭腹腔。耳缘静脉补给生理盐水 20 mL ，内加入青霉素 20 万 U，兔子苏醒后放入笼中饲养。第 2 组在腰背静脉剪一小口灌注灌注液，肾动脉侧处剪一小口作为灌注液出口，余同对照组。 观察指标：2 组兔子术前取静脉血 1 mL，术后各取第 1、2、3、5、7 天静脉血，第 1 天取 2 mL，其他 4 d 各取 1 mL血，第 7 天取常规病理组织及电镜组织。肾脏标本采集将兔子麻醉、固定后沿原切口打开腹腔，直视下枪式肾活检穿刺针穿刺 3 条组织，立即放入 0~4 ℃的戊二醛液内固定，送昆明医学院电镜室观察肾小管超微结构，切除肾脏 1/2 以 10%甲醛固定，送昆明医学院病理教研室行 HE 染色。 1.3 统计学方法 采用 SPSS 13.0 软件，数据以 x-plusmn;s 表示，均数间的比较用 t 检验，Plt;0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 术后兔子存活好，取肾脏病检时可见肾脏充盈好，肾动、静脉没有栓塞或者闭塞。两组血清肌酐 (SCr)、尿素氮(BUN) 值在不同的时间点 ( 术后 1、2、3 d) 差异有统计学意义 (Plt;0.05)。逆行灌注组肾功能指标明显好于顺行灌注组，术前、术后第5、7天各组间均数差异没有统计学意义(Pgt;0.05)见表 1、2。 表 1 两组血清尿素氮比较 (n=10, xplusmn;s) 注：▲顺行灌注组与逆行灌注组差别无统计意义 (Pgt;0.05)；△顺行灌注组与逆行灌注组差别有统计意义 (Plt;0.05) 表 2 两组血清肌酐比较 (n=10, xplusmn;s) 注：▲顺行灌注组与逆灌注组差别无统计行意义 (Pgt;0.05)；△顺行灌注组与逆行灌注组差别有统计意义 (Plt;0.05) 二组兔肾在光镜下可见逆行灌注组近端小管上皮细胞轻度肿胀，肾小管结构完整，远端小管管腔扩张，部分细胞可见胞浆内空泡形成，组织周围渗出较顺行灌注组损伤轻。 3 讨论 从解剖学的观点来说，肾实质内静脉无节段性 , 各肾段之间存在丰富的吻合，经肾静脉灌注，如多支肾静脉，即使一支肾静脉畸形、损伤或太细，从另一支肾静脉灌注，也能迅速灌白整个肾脏。肾动脉在肾内的分布呈节段性，一般分为 5 个肾段，肾段之间的动脉缺乏交通支，当一支段动脉梗塞后可造成该肾段的坏死。