剖析抗凋亡多对动脉粥样硬化模型小鼠血小板的作用.docVIP

剖析抗凋亡多对动脉粥样硬化模型小鼠血小板的作用 　　血小板除了众所周知的参与止血与维持单层内皮细胞完整性功能以外,在病理条件下还能够参与动脉粥样硬化与血栓的形成 ,同时促进动脉粥样硬化的发展,尤其是在高脂状态下,血小板对于激动剂的敏感性增高,并且高敏感性血小板能够与血管内皮相互作用,诱导血管内皮细胞分泌黏附分子,还能够释放趋化因子和细胞因子,趋化单核/ 巨噬细胞、中性粒细胞等炎症相关细胞向附近血管壁部位黏附,最终通过黏附、迁移和浸润作用进入血管内膜下,促进炎症反应及动脉粥样硬化的发展。抗凋亡多肽Humanin 是由编码线粒体16SrRNA 的DNA 序列转录翻译所合成,它是由24 个氨基酸所组成的多肽。首次发现它,是从阿尔茨海默病患者脑中提取出来的,是一种内源性抗细胞凋亡的多肽。最初发现Humanin 能够对抗由淀粉样蛋白和许多家族性突变所诱导的神经细胞凋亡。近期发现该多肽在其他许多组织中有表达,且在各自组织中也发挥抗凋亡及更广泛的作用。心肌缺血和脑缺血再灌注损伤中起到一定的保护作用。最近有文章报道Humanin 在糖尿病中也发挥着重要作用并因性别不同在血浆中的水平也有一定的差异。已知Humanin 在血管内皮细胞中表达,能够通过抑制氧化型低密度脂蛋白所诱导的活性氧产生以及内皮细胞凋亡,从而缓解动脉粥样硬化发展,但Humanin 能否通过其他途径,如在高脂血症状态下抑制血小板的高敏感性缓解动脉粥样硬化发展,并没有报道。本文旨在探讨抗凋亡多肽Humanin 是否能够影响高脂血症下血小板的高反应性,以及是否能够影响高脂血症下明显增高的血脂含量和体内动脉粥样硬化脂质斑块形成大小,最终影响动脉粥样硬化的发展。在实验过程中,我们使用了Humanin 的衍生物HNG,HNG 多肽是Humanin 在14 位氨基酸由丝氨酸突变为甘氨酸,其抗凋亡活性比Humanin 高1000 多倍,更具有临床应用价值,而且HNG 在其他病理研究中也被广泛采用,如心肌缺血和脑缺血再灌注小鼠模型中。因此,我们应用LDLR- / - 小鼠建立了动脉粥样硬化模型,并模仿临床治疗中,长期持续进行HNG 多肽的注射来研究该多肽在动脉粥样硬化生理机制中的所起的效应。力图发现新的诊断和干预靶点,为血管性疾病的病理性血栓及其并发症的预防和诊疗提供理论基础和应用依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要材料及仪器 　　C57BL/6 背景LDLR- / - 小鼠从Jackson Lab(Brass 实验室引进) 引进,运抵苏州大学实验动物中心,进入SPF 级环境饲养。体式显微镜及CCD 显微成像系统购自上海精密仪器仪表有限公司。血小板聚集仪购自Chrono-log 公司。 　　1.2 动物分组LDLR- / - 小鼠与野生型WT 小鼠交配得到LD-LR+ / - 杂合子后代,后用LDLR+ / - 杂合小鼠雌雄相互交配,经基因鉴定得到LDLR+ / + ( 即WT) 与LD-LR- / - 小鼠,挑选同窝8 周龄雄鼠,LDLR+ / + 小鼠喂食普通饲料作为对照组( CD 组),实验组LDLR- / -小鼠喂食高脂饲料, 再分为两亚组, 一是模型组(HFD 组),喂食高脂饲料同时每天每只小鼠腹腔注射生理盐水200 mu;L,另一组为HNG 组(HFD + HNG组),在喂食高脂饲料的同时,每天每只小鼠腹腔注射1 mu;g HNG(日本PEPTIDE 公司购买),HNG 溶于200 mu;L 生理盐水中。以上分组小鼠再按照实验要求,持续喂养和注射HNG 到4 周、12 周和24 周三个不同时间点,取血脂、血小板或剥离冠状及胸主动脉等处理。 　　1.3 LDLR 基因敲除小鼠鉴定方法由LDLR+ / - 小鼠相互交配得到的小鼠出生1个月后标记上耳号后,按照Brass 实验室提供的引物和条件进行鉴定。首先剪取小鼠尾巴,通过基因组DNA 提取试剂盒的说明提取出基因组DNA 模板。引物为LDLR-F、LDLR-R、LDLR-Common ( 表1),其中每只小鼠用2 个管进行鉴定,一管中的引物为LDLR-F 与LDLR-Common(有LDLR+ 基因则能合成出380 bp 片段,没有LDLR+ 基因跑不出DNA片段),另一管中为LDLR-R 与LDLR-Common( 有LDLR- 基因则能合成出550 bp 片段,没有LDLR-基因跑不出DNA 片段),然后通过PCR 技术及凝胶成像系统鉴别出小鼠基因型。PCR 程序为90ordm;C 变性1 min,94ordm;C 变性30 s,61ordm;C 退火30 s,72ordm;C 延伸1 min,72 ordm;C 延伸7 min, 4ordm;C 保冷,共35 个循环。