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分析颅骨来源骨髓基质干细胞的分离培养方法 　　0 引言 　　Introduction来源于大鼠颅骨的骨髓基质干细胞具有与来源于小鼠颅骨的骨髓基质干细胞(Polyamide 6，PA6)相类似的特性，与其他干细胞共培养时具有向神经细胞诱导分化的能力。尽管它的分子组成尚未得知，但对于PA6细胞在临床上的应用已成为研究热点之一。Lohle等研究发现诱导多能干细胞与PA6细胞共培养能够促进基质干细胞诱导转化成为神经元，并且神经元具有高效率的分泌酪氨酸羟化酶的能力。Torres等采用胚胎干细胞和PA6两种细胞与骨形态发生蛋白共培养，研究发现，PA6细胞和骨形态发生蛋白4共培养后都具有胚胎干细胞独特的自我更新能力，并能够引起肌间线蛋白和神经巢蛋白的双阳性表达。可见，PA6细胞的应用已受到研究者的广泛关注，国内对PA6细胞的应用率较高，但对PA6细胞的具体提取方法鲜见报道，常从美国、日本等国家进口，不仅价格昂贵，而且需要时间较久，进入实验室的细胞状态相对比原代提取的细胞相差较远，所以基于以上调查，作者试图探索一种方法能够从大鼠颅骨内提取与小鼠PA6细胞相类似的骨髓基质干细胞。如何获得PA6细胞，如何快速高效地获取大量高纯度、高活性的PA6细胞是研究的基础。PA6细胞培养的关键在于取材的部位以及去除成纤维细胞的污染。为了获得高纯度、高活性的骨髓基质干细胞，产生了多种分离和纯化细胞的方法，包括成纤维细胞抑制法、冷洗涤法、免疫选择分离法、植块法、酶消化法、植块法与酶消化法、刺激因子增殖法等。成纤维细胞形态宽大较扁平，且有几个不规则的短突起，其胞体和突起均有贴壁能力，通过观察可直接分辨。由于骨髓基质干细胞与成纤维细胞的贴壁能力不同，可在消化细胞时间上做出调整，目的是去除成纤维细胞。实验在骨髓基质干细胞传统培养方法的基础上进行了改良，取材部位选择乳鼠的颅骨，在去除成纤维细胞环节基于传统酶消化法的基础上，结合实验研究中发现的颅骨骨髓基质干细胞贴壁能力强的特点，试图发现一套比较简洁而经济的培养提纯颅骨骨髓基质干细胞的方法，即颅骨骨髓贴壁筛选法，希望为国内骨髓基质干细胞的应用和发展奠定基础。 　　1 材料和方法 Materials and methods 　　设计：观察性实验。 　　时间及地点：实验于2012年10至12月在牡丹江医学院医药研究中心完成。 　　实验动物：新生SD大鼠，雌雄不限，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(黑)2006-010。实验过程中对动物处置方法符合中华人民共和国科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。 　　实验方法：颅骨来源的骨髓基质干细胞的制备：新生SD大鼠用乙醚麻醉后处死，碘伏浸泡15-20 min，在超净工作台上无菌操作取颅骨，将其剪碎，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液浸泡颅骨碎片，反复吸打多次，收集骨髓冲洗液，200目细胞筛网过滤，除去块状肌肉组织和骨渣，制成单细胞悬液。然后以1times;108 L-1细胞浓度接种于培养瓶中，37 ℃恒温、体积分数为5% CO2培养箱中培养，72 h首次更换培养液，去除未贴壁细胞;当细胞再次贴壁生长后，加入不含乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA)的胰蛋白酶，37 ℃水浴锅中消化2.0-3.0 min，目的是去除贴壁细胞中的成纤维细胞，使细胞纯化;以后 3 d换液1次，当细胞铺满整个培养瓶底部80%以上时，传代培养。颅骨来源的骨髓基质干细胞形态学观察：于倒置显微镜下观察第2代骨髓基质干细胞形态。 　　颅骨来源的骨髓基质干细胞的鉴定：取第2代颅骨来源的骨髓基质干细胞玻片，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，山羊血清封闭60 min，分别滴加CD105、CD73、CD44、CD90、CD45、CD34、CD14和HLA-DR 8种单克隆抗体，37 ℃恒温孵育120 min，加入二抗DAPI(5 mg/L)核染色，荧光显微镜下观察拍照。 　　主要观察指标：骨髓基质干细胞形态，免疫荧光染色法鉴定颅骨来源骨髓基质干细胞的表面标记。 　　2 结果 Results 　　2.1 细胞形态学观察 　　颅骨骨髓基质干细胞刚接种时，细胞体积较大，呈圆球形，悬浮于培养液中;细胞培养过24 h后，骨髓基质干细胞开始贴壁，大部分为骨髓基质干细胞，少量为成纤维细胞;培养3 d后，细胞数量增多，形态呈不规则形、多角形、三角形和扁平形;在细胞传代后，形态基本均一，细胞呈放射状和束状排列，贴壁能力较强，部分细胞呈聚集生长，增殖速度比原代明显加快。 　　2.2 颅骨来源骨髓基质干细胞的鉴定 　　经免疫荧