二甲双胍对高糖培养H9c2细胞Connexin43表达带来的影响.docVIP

二甲双胍对高糖培养H9c2细胞Connexin43表达带来的影响 　　超过5%的糖尿病患者死亡原因归于心血管疾病。糖尿病可以引起多种并发症，如心肌梗死、糖尿病心肌病，糖尿病肾病等。因此严格的血糖控制对糖尿病患者来说显得尤为重要。 　　在心肌细胞闰盘处存在一种缝隙连接(gapjunction，GJ)通道，由缝隙连接蛋白(connexin，Cx)组成。它是心肌细胞间电、化学信号偶联通道，不仅可以进行细胞间物质交换，如离子、ATP等，还可以传导电信号，实现心肌细胞同步性舒缩，完成泵血过程。心室肌细胞闰盘处主要存在缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)。研究表明，Cx43的表达或分布异常与许多疾病相关，如心律失常、高血压、动脉粥样硬化等。研究发现高血糖情况下Cx43的表达降低、分布异常、心律失常发生率增加。这些证据提示Cx43在维持心脏正常功能中起着至关重要的作用。 　　二甲双胍是最常用的口服降糖药，广泛用于治疗2型糖尿病患者。研究表明，二甲双胍能改善骨骼肌胰岛素抵抗，减少糖尿病患者全因死亡率和心血管事件发生率。此外，二甲双胍还能改善心肌梗死后重构效应及炎症反应，降低糖尿病患者房颤发生率。但二甲双胍发挥心血管保护作用是否与心肌Cx43变化有关，目前尚无定论。本研究拟在H9c2大鼠心肌细胞系中，观察二甲双胍对高糖培养的H9c2细胞Cx43表达的影响及其潜在机制。 　　1　材料与方法 　　1.1　材料与试剂　大鼠心肌细胞株H9c2(2.1)购自中国科学院上海细胞库;Cx43、AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)、磷酸化的AMP依赖的蛋白激酶(PAMPK)、GAPDH抗体购自CellSignalTechnology公司;羊抗兔二抗购自武汉谷歌生物有限公司;二甲双胍(metformin，Met)、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(methylthiazolyltetrazolium，MTT)购自Sigma公司;DMEM、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;ROS检测试剂盒、LDH检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术公司;增强型化学发光(ECL)显影液购自Thermo公司;EPOCH型多功能酶标仪购自BioTek公司;PowerPacUniversal电泳装置购自Biorad公司。 　　1.2　细胞培养及分组　用含10%FBS的DMEM培养液培养H9c2细胞，放在含5% CO2，95%O237℃培养箱中。当细胞长满培养皿80%～90%时，用PBS缓冲液冲洗3遍，加1mL0.25%的胰酶使其与细胞充分接触，消化1min，再加3mL的DMEM培养基终止消化。将细胞悬液加入离心管中，以900g离心3min，去除上清，将细胞稀释后转移至6孔板继续培养。待细胞长满80% 左右，在高糖(250mmol·L-1)培养的H9c2细胞中分别加3mu;mol·L-1Met(Met3)和5mu;mol·L-1Met(Met5)继续培养24h，另设对照组(不含Met，Con)。 　　1.3　细胞活力检测　称取适量的MTT，溶解于去离子水中，使其终浓度为05g·L-1，继续培养4h，去除上清，每孔加DMSO150mu;L，快速震荡10min，使结晶充分溶解。然后在酶标仪测吸光度在490nm处的吸光度值[D(490nm)]。 　　1.4　细胞毒性检测　按照试剂盒说明书方法进行操作。简言之，待细胞长满80%左右，设置以下几组：背景空白对照孔、样品对照孔、样品最大酶活性对照孔、不同药物浓度处理样品孔。到达预计检测时间点前1h，在样品最大酶活性对照孔加入原有体积10%的LDH释放液并混匀。到达预定时间后，每组取120mu;L的上清加入96孔板中，同时加入60mu;LLDH检测工作液，室温避光30min，在490nm处测吸光度。细胞毒性/% =(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)times;100。 　　1.5　细胞免疫荧光检测　细胞爬片之后，进行预定时间药物处理，然后用PBS清洗3次，每次3min;用4%的多聚甲醛室温固定30min，PBS清洗3次，每次3min。在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min，吸水纸吸掉封闭液加入Cx43的一抗，4℃孵育过夜。清洗玻片上多余的一抗，加荧光二抗室温避光孵育1h，滴加DAPI避光孵育5min，清洗封片，用荧光显微镜观察采集图像。 　　1.6　ROS检测　细胞处理到达预定时间点后，用无血清培养液按照1∶1000的比例稀释DCFHDA，使其终浓度为10mu;mol·L-1。去除细胞培养液，每孔加入1mL稀释的DCFHDA，放在37℃细胞恒温孵育箱中孵育40min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3