寿胎丸对复发性流产小鼠蜕膜组织α—烯醇化酶表达的影响.docVIP

寿胎丸对复发性流产小鼠蜕膜组织α—烯醇化酶表达的影响 　　摘要：目的 通过观察寿胎丸对复发性流产小鼠蜕膜组织α-烯醇化酶表达的影响，探讨其安胎的作用机制。方法 CBA/J×BALB/C建立正常妊娠模型，CBA/J×DBA/2建立复发性流产模型，将复发性流产模型CBA/J×DBA/2孕鼠按怀孕先后顺序随机分为模型组及寿胎丸高、中、低剂量组，从妊娠第1日开始灌胃给药，至孕14 d处死小鼠，采用免疫组化与蛋白印迹方法检测各组蜕膜组织α-烯醇化酶的表达。结果 小鼠模型组与正常组比较，α-烯醇化酶表达明显升高，差异有统计学意义（P0.05）。结论 寿胎丸通过下调复发性流产小鼠蜕膜组织α-烯醇化酶的表达，从而实现维持妊娠，这可能是其安胎的作用机制之一。 　　关键词：寿胎丸；复发性流产；蜕膜组织；α-烯醇化酶；小鼠 　　自然流产系指妊娠不足28周、胎儿体质量不足1000 g而终止者，当自然流产连续发生2次及以上时则称之为复发性流产。复发性流产属中医学“滑胎”范畴，多为先天不足，复损肾气，以致不能荫胎系胎。寿胎丸源自张锡纯的《医学衷中参西录》，临床上用于治疗滑胎[1-3]。本课题前期进行了蛋白质组学研究，相关实验观察到复发性流产小鼠蜕膜组织中α-烯醇化酶表达升高，与模型组比较，寿胎丸各组该蛋白质点表达明显降低[4]。为了进一步验证其结果，本实验拟采用免疫组化与蛋白印迹方法检测寿胎丸对复发性流产小鼠蜕膜组织α-烯醇化酶表达的影响，探讨寿胎丸安胎的分子机制。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　健康雌性CBA/J小鼠50只，SPF级，8周龄，中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（京）2009-0004；健康雄性DBA/2小鼠20只，SPF级，8周龄，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2007-0005；健康雄性BALB/C小鼠5只，SPF级，8周龄，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2009-0004。 　　1.2 药物 　　寿胎丸由菟丝子、桑寄生、续断、阿胶组成，湖南中医药大学附属第一医院药剂科按照《医学衷中参西录》[5]寿胎丸处方用量比例配伍，采用水提醇沉法制备浓缩液（含原药材1 g/mL）。 　　1.3 主要仪器与试剂 　　BMJ-1生物组织包埋机（天津航空机电公司）， Shandon325石蜡切片机（英国Shandon公司），LEICA DM LB2双目显微镜（德国LEICA公司），Motic B5显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司），MIAS医学图像分析系统（北航公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司），紫外分光光度计（美国Beckmen公司），垂直电泳槽、转移电泳槽及电泳仪（美国Bio-Rad公司），图像扫描仪（美国Bio-Rad公司），Kodak Digital Science ID图像分析系统（美国Kodak公司）。免疫组化HSP27一抗、SABC试剂盒及DAB显色试剂盒（美国Proteintech公司）；蛋白印迹HSP27一抗、β-actin一抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗试剂盒及ECL发光试剂盒（美国Bethyl公司）。 　　2 实验方法 　　2.1 造模 　　将50只雌性CBA/J小鼠分别与20只雄性DBA/2和5只雄性BALB/C小鼠按2∶1合笼交配，检到阴栓者计为妊娠第0日，分别建立复发性流产模型40只与正常妊娠模型10只。 　　2.2 分组与给药 　　10只CBA/J×BALB/C孕鼠作为正常妊娠组，40只CBA/J×DBA/2孕鼠作为复发性流产模型。按妊娠顺序随机分为模型组及寿胎丸低[3 g/（kg·d）]、中[6 g/（kg·d）]、高[12 g/（kg·d）]剂量组，每组10只。自妊娠第1日开始，正常妊娠组和模型组给予等量的生理盐水灌胃，寿胎丸各组给予不同剂量的寿胎丸混悬液灌胃，直至孕14 d。 　　2.3 标本制备 　　断颈处死孕14 d小鼠，妊娠子宫离体后，自子宫角处钝性撕开子宫壁，将胎儿胎盘单位从着床部位剥离，用小号组织剪刀分离着床部位的蜕膜组织，取5个着床部位，用预冷的PBS冲洗干净后，迅速置于液氮中保存。切取1 cm大小的子宫组织（含蜕膜组织），修整后用PBS冲洗，迅速放入4%多聚甲醛固定液（含有1‰DEPC）固定12 h，将固定好的蜕膜组织取出，室温下经梯度酒精脱水（70%A→80%A→95%AⅠ→95%AⅡ→100%AⅠ→100%AⅡ），二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，备用。 　　2.4 免疫组化检测 　　石蜡切片厚度5 ?m，常规脱蜡至水，3%H2O2 10 min，抗原修复10 min，一抗4 ℃过夜，二抗37 ℃ 30 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、