姜黄素增强宫颈癌放疗疗效的实验研究.docVIP

姜黄素增强宫颈癌放疗疗效的实验研究 　　【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2013）12-0188-01 　　【摘要】目的 观察姜黄素对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用。方法 MTT法检测姜黄素和放射线对Hela细胞的抑制作用，绘制细胞抑制率曲线，研究姜黄素与放射联合应用时的作用特点；流式细胞法检测细胞周期和凋亡。结果 姜黄素对Hela细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈时间和浓度依赖性；单纯照射对宫颈癌增殖有平台效应， 联用姜黄素则可进一步增强对宫颈癌的杀伤效应；单独照射和姜黄素均能使细胞周期阻滞于放射敏感时相G2/M期，诱导细胞凋亡，联合作用效果更加显著。结论 姜黄素可通过阻滞细胞周期于G2/M期对宫颈癌Hela细胞产生放疗增敏作用。 　　放射治疗是宫颈癌的重要治疗手段，对宫颈癌的照射不可避免的会对宫颈周围膀胱、直肠等器官造成辐射损伤 [1]。故而，采用同步放化疗综合治疗模式，即通过同步应用小剂量化疗药物在不增加甚至降低射线剂量的基础上达到增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用已被广泛应用于临床多种肿瘤的治疗[2]。 　　姜黄素具有多种药理活性。有研究表明姜黄素对胰腺癌[3]、肾癌[4]、前列腺癌[5]具有放疗增敏作用，但对宫颈癌放疗作用报道较少，本文通对此进行了研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人宫颈癌Hela细胞株（湖北医药学院临床研究所）；姜黄素（HPLC98%，成都思科华生物技术有限公司）；Clinac 600C/D加速器（ 美国Varian 公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coluter公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1细胞培养 宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常规培养，每2-3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。 　　1.2.2照射方法 在室温下采用6MV-X线照射，照射野10×10cm，剂量率40 cGy/min，源皮距为100cm，分别一次性给予各实验组6、8、10、12、14、16Gy剂量。 　　1.2.3放射线对Hela细胞增殖的影响 取对数生长期Hela细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，参照文献按辐射剂量分为6、8、10、12、14、16Gy共6组，每组设5个复孔，给予一次性射线照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），继续孵育4h，弃各孔液体，每孔加入150μL二甲基砜，低速震荡10min，酶标仪检测各孔在562nm波长处吸光度值，计算抑制率，求出辐射剂量坪值，即细胞增殖抑制率达最高的射线剂量。细胞抑制率=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值） ×100%。 　　1.2.4MTT法测定姜黄素的辐射敏感性 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，分为空白组、单药组、单放组、药放组。空白组只加细胞与培养液；单放组剂量取上述实验的坪值；单药组姜黄素终浓度参照文献确定为50，25，12.5，6.25，3.125μmol/L共5组，药放组辐射剂量和药物浓度分别同单放组剂量和单药组浓度，共5组，每组设5个平行样本，测定各组吸光值后通过公式计算细胞抑制率。 　　1.2.5细胞周期分析及凋亡检测 细胞分组及处理同1.2.4，取处理完毕的4组细胞各1×106个， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定过夜，清除固定液，加入PBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。 　　1.3统计学分析 所得数据以均数±标准差（x±s）的形式表示，SPSS17.0软件模拟生存曲线并进行单因素方差分析（两两比较采用S-N-K法），以P0.05为差别有统计学意义，以P0.01为差别有显著性统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 Hela细胞对射线照射的敏感性 射线照射对宫颈癌细胞增殖可产生明显的抑制作用，在射线剂量12Gy以内时，随着射线剂量的加大和照射后作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也明显增加，呈现出一定的量效和时效关系。在12Gy处出现坪值，故选用12Gy加药物进行后续的增敏实验。 　　2.2姜黄素对Hela细胞增殖的影响 经不同浓度姜黄素作用24、48、72h后，Hela细胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈时间，浓度依赖性。各浓度姜黄素作用48h，细胞增殖抑制率在7%-81%之间，与对照组比较，12.5μmol/L姜黄素即可产生有统计学差异的抑制作用（P0.05），而25μmol/L及以上浓度的姜黄素抑制作用则更强（P0.01）。