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植物体内脯氨酸含量测定
植物体内脯氨酸的含量细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用,它的选择透性是其最重要的功能之一。当植物遭受逆境伤害时,细胞膜受到不同程度的破坏,膜的透性增加,选择透性丧失,细胞内部分电解质外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此,质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标,广泛应用在植物抗性生理研究中。当质膜的选择透性被破坏时细胞内电解质外渗,其中包括盐类、有机酸等,这些物质进入环境介质中,如果环境介质是蒸馏水,那么这些物质的外渗会使蒸馏水的导电性增加,表现在电导率的增加上。植物受伤害愈严重,外渗的物质越多,介质导电性也就越强,测得的电导率就越高(不同抗性品种就会显示出抗性上的差异。)蛋白质 水分子
疏水端脯氨酸亲水端脯氨酸是水溶性最大的氨基酸,具有很强的水合能力,其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合,亲水端可与水分子结合,蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水,从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用,而且即使在含水量很低的细胞内,脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水,以维持正常的生命活动。正常情况下,植物体内脯氨酸含量并不高,但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加,它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况,以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。 植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下,脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物,该产物在 520nm 有一最大吸收峰,其色度与含量正相关,可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性,酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物,碱性氨基酸对这一反应有干扰,但加入人造沸石(permutit ),在 PH 1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸,精氨酸等 2 —氨基的氨基酸)。
[ 实验材料 ] 绿豆幼苗
[ 仪器设备 ] 分光光度计、水浴锅、天平、带塞试管、研钵、石英砂、漏斗、滤纸、玻棒、电导率仪、微波炉、移液管、试管、 50mL 小烧杯等
【试剂药品】
1 .无离子水
2 . 80% 乙醇。
3 .酸性茚三酮试剂:称取 2.5g 茚三酮,加入 60mL 冰醋酸和 40mL 6mol/L 磷酸,于 70 加热溶解,冷却后储于棕色试剂瓶中,4 保存,两天内稳定。
4 .脯氨酸标准母液:称取 10mg 脯氨酸溶于少量 80% 乙醇中,再用蒸馏水定容至 100mL, 成 100μg/L 母液。
5 .人造沸石、活性碳等。
【实验步骤】 取绿豆种子,用水吸胀,萌动后加洗净的河沙覆盖,放在光照培养箱中培养( 25 ,每天光照 12h ),当苗高 3~5cm 时,即可进行干旱 胁迫 处理。
?? 一盆浇充足水分作为对照,另一盆干旱处理 24h 。
?? 肉眼观察伤害症状。
?? 取样和测定
测相对电导率:
每份取 2g (地上部分),剪成小段( 1.0cm 左右),置小烧杯中,用去离子水洗三次,沥干,准确加入 20ml 去离子水,放置 1h, 摇匀 , 用 DDS -11A 电导率仪测得的电导率为 R 1 。将材料于微波炉中煮沸,彻底破坏材料的膜结构,冷却至室温后,测电导率 R 2 。
测脯氨酸含量:
1 .脯氨酸标准曲线制作:吸取脯氨酸标准母液 0, 0.5, 1.25, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0mL 分别放入 8 个 50mL 容量瓶中,分别加入蒸馏水定容至 50mL ,配成 0.0 , 1.0 , 2.5 , 5.0 , 10.0 , 15.0 , 20.0 , 30.0μg/mL 的系列溶液。分别吸取上述各标准溶液 2mL ,冰醋酸 2mL ,茚三酮试剂 2mL ,加入到 10mL 带塞刻度试管中,塞上塞子,于沸水浴中加热 15 分钟,用分光光度计测定 520nm 的光密度值,以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标制作标准曲线。
2. 测定样品的脯氨酸含量
( 1 )提取脯氨酸:分别称取胚轴,每种处理各取三份,每份 0.3g 。剪碎,加入适量 80% 乙醇,少量石英砂,于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至 25mL 刻度试管中,用 80% 乙醇洗研钵,将洗液移入相应的刻度试管中,最后用 80% 乙醇定容至刻度,混匀, 80 水浴中提取 20 分钟。
2 )除去干扰的氨基酸: 向提取液中加入约 0.4g 的人造沸石和 0.2g 活性碳,强烈振荡 5 分钟,过滤,滤液备用。
( 3 )脯氨酸含量的测定: 分别吸取上述提取液 2mL 于刻度试管中,再取一支刻度试管,加入 2mL 80% 乙醇作为参比,分别向上述各试管中加入 2mL 冰醋酸和
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