植物组织中游离脯氨酸含量的测定.docVIP

植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、原理 当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。植株体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植株体内的水分情况。因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。 用人造沸石在pH l—7范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应 如甘氨酸、谷氦酸、天冬氨酸、丙氨酸、绩氨酸、肮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等 ，脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。此法有专一性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 1．实验材料 植物叶片。 2．试剂 1 80％乙醇。 2 人造沸石。 3 活性炭。 4 茚三酮试剂：将2.50 g茚三酮于60ml冰醋酸和40ml 6mol/L磷酸中,加热 70℃ 溶解。试剂至少在24h内稳定。 5 脯氨酸标准液：准确称取25mg脯氨酸溶于少量80％乙醇中，再用蒸馏水定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成l0μg/ml的脯氨酸标准液。 3．仪器设备 分光光度计，水浴锅,移液管，容量瓶，冰醋酸，仪器药品，离心机，烧杯，试管，恒温水浴。 1．绘制标准曲线 吸取脯氨酸标准母液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml分别放入7支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至2.0ml，其脯氨酸含量分别为O、2.0、4．0、8．0、12.0、16.0、20.0μg。分别吸取上述标准溶液2ml，加冰醋酸2ml，茚三酮试剂2ml加入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热15min。用分光光度计于波长515nm下进行比色测定，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线. 2．植核样品液的提取 选取植株功能叶片2g，用3ml 80％乙醇研磨 放少许石英砂 成浆状。用80％乙醇洗研体，将提取物和洗液置于试管中。80％乙醇总量为10ml。加盖置于黑暗中室温下提取24h，或80%恒温水浴中提取20min。 将提取液在放有活性炭的滤纸上进行过滤，重复过滤一次，除去色素和残渣。将滤液置于试管中，加其重量1/5的人造沸石强烈振荡5min。将上层液在离心机上离心10min，上清液备用。 3．样品溶液的测定 取2ml上清液置于试管中，再加入2ml的冰醋酸和2ml茚三酮试剂，加盖密封，在沸水浴上加热15mln。用3ml 80％乙醇代替样品液作为对照。在分光光度计上测515nm处各样品的吸光度，从标准曲线上求出样品溶液中脯氨酸含量。 四、结果计算 样品中脯氨酸含量的计算： 脯氨酸含量（μg/g） C×VT/W×V1 式中：C—由标准曲线上查得的脯氨酸的质量，μg。 VT—提取液总体积，ml。 W—样品质量，g。 V1—测定液体积，ml。