ndvf和ibv vp2多表位串联苗诱导小鼠体液免疫的初步比较.pdf

万方数据 中文摘要 新城疫(ND)和传染性法氏囊病(IBD)是危害养禽业的两大疾病，其死亡率 高，能够造成极大的经济损失。疫苗免疫是预防这两种疾病的有效手段。目前疫 苗的使用使这两种病得到一定的控制。但是也存在着ND 多次免疫仍出现非典型 ND现象，IBD也出现强毒株的感染，屡屡导致免疫失败。当前，多表位疫苗是 研究热点之一。与传统疫苗相比，其应用性和可操作性极大，表位的联合、修饰 或改造在质粒水平上可以及时方便的操作。 研究表明，恒定链（invariantchain，Ii）在抗原递呈过程中起重要作用。Ii CLIP N LRMK Ii-key 中与 区 端相连的四个氨基酸序列 称为 ，具有增强免疫应答 的作用。Ii-key 已被作为免疫载体与抗原表位相连；Ii 的其他区域能促进这种免 疫增强作用。文章旨在以鼠Ii功能片段作为免疫载体，构建含NDV、IBDV 的4 组不同串联方式的多表位疫苗，研究多表位苗能否诱导产生针对不同病毒的抗 体，及表位串联顺序的不同对免疫原性是否有影响，以期获得最佳的免疫原性。 首先，选择了NDV抗原表位F306及IBDV抗原表位VP2与鼠Ii 的胞浆区、 Ii-key Cyt/TM/Ii-key/F306 Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2 跨膜区、 构建串联嵌合体： 、 、 Cyt/TM/Ii-key/VP2、Cyt/TM/Ii-key/VP2/F306。以实验室原有的质粒pEGFP-C1-Ii、 pET-32a-F306、pET-32a-VP2为模板，根据设计成功的引物，将扩增出来的目的 片段插入原核表达载体pET-32a 中。通过质粒双酶切鉴定及质粒测序结果比对， 表 明 构 建 了 正 确 的 重 组 质 粒 ： pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/F306 、 pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2、pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/VP2、pET-32a-Cyt/TM/ Ii-key/VP2/F306 pGEX-4T-1-F306 pGEX-4T-1-VP2 ，同时以构建的 、 作为检测抗原。 其次，将构建的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta工程菌中，通过优化融合蛋 白的表达条件，确定最佳诱导时间为4h，最佳诱导浓度为0.8mmol/L。用此最佳 表达方法进行蛋白的大量表达。经改良KCl染色切胶法纯化回收目的蛋白，最 后获得分子量约为41.35kDa、43.22kDa、31.56kDa、43.22kDa、37.22kDa、27.43kDa 的六组纯化蛋白。采用Folin-酚法检测各融合蛋白的浓度，六组蛋白浓度检测结 His-Cyt/ /Ii-key/F306 1.47mg/mL His-Cyt/ /Ii-key/F306/VP2 0.91 果： M 为 、 M 为 mg/mL、His-Cyt/ M/Ii-key/VP2为0.78mg/mL、His-Cyt/ M/Ii-key/VP2/F306为0.96 mg/mL、GST-F306为0.93mg/mL、GST-VP2为0.85mg/mL，均达到后续实验的 要求。 最后，免疫Balb/c小鼠，三免后采血制备多克隆抗体。确定最佳抗原工作 浓度为2.0μg/mL，最佳抗体稀释浓度为1:2000。用间接ELISA方法检测血