实验室猪精液检查及人工授精技术..pptVIP

精子不同区域质膜的检测 覆盖于顶体外 膜区上的质膜 覆盖于精子头部 非顶体区的质膜 覆盖于尾部的质膜 荧光染料，如碘化丙锭（PI）、溴化乙锭（EB）、DAPI、 Hoechst 33258等 非荧光染料，如伊红—苯胺黑、伊红—苯胺蓝等 精子的低渗肿胀实验（HOST）检测 通常与顶体外膜完整性的检测联合起来进行 原理： 低渗溶液中，有生物活性的精子质膜会使水分子进入质膜中，水的内流使精子尾部的质膜膨胀并且尾部会发生弯曲。 若精子质膜损伤或失去生物活性，水能够自由通过质膜，在胞质内不会积聚液体，从而不会出现肿胀和尾部弯曲。 等渗液 等渗液 低渗液 精子低渗肿胀检测（HOST） 进入低渗液 进入等渗液 膜完整精子的变化 Q1: PI染色的死精子； Q4: SYBR-14染色活精子； Q2: SYBR-14/PI染色，正在死亡的精子； Q3: 杂质颗粒，无颜色。 精子质膜检测新方法 SYBR-14和PI的联合染色 显微镜进行检测 A：PI染色的死精子，为红色； B：SYBR-14染色活精子，为绿色，膜功能完整； C：SYBR-14／PI染色，正在死亡的精子。 流式细胞仪检测 A A B B C C 线粒体功能检测 精子线粒体检测方法 检测线粒体的染料分类 1 2 检测线粒体的染料分类 染料名称 染色特性 R123 （Rhodamine123） MITO （MitoTracker Green FM） JC-1 （5,5,6,6-tetrachloro-1,1 ,3,3-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine iodide） 1. 渗透并沉积在正常线粒体上，发绿色荧光； 2. 若线粒体损坏则不发荧光。 1. 当积聚在线粒体内时会发绿色荧光。 1. 线粒体膜电位低时，发绿色荧光； 2. 膜电位高时发橙色荧光。 精子线粒体检测新方法 PI与J C-1联合染色 流式细胞仪检测： D：多边形内的精子，为高能线粒体精子 多边形外的精子，为低能线粒体； E-Q1：死精子； E-Q2：活精子高能线粒体； Q1Q2以外：为活精子低能线粒体； D E 荧光显微镜检测： A：活精子高能线粒体 头无色或微绿，尾橙色； B：死精子高能线粒体 头红色，尾橙色； C：死精子低能线粒体 头红色，尾微绿或无色。 A B C JC-1单染 JC-1/PI双染 获能和顶体检测 顶体检测 获能检测 精子膜的获能状态改变很容易引起顶体反 应的提前发生，以及精子受精能力的丧失 顶体反应是精子成功穿入卵母细胞所必需的过程。 顶体内富含多种蛋白水解酶（顶体酶），在精子穿过卵子放射冠、透明带等受精过程中发挥主要作用。 一 二 获能检测 采用金霉素 (CTC) CTC 进入精子可以结合游离的钙离子，形成CTC-Ca2+ 复合物，在荧光显微镜下激发出黄绿色荧光 ① F型，整个精子头部有均一荧光，为未获能，顶体完整的精子； ② B型，精子头前部为均一荧光，在靠近颈部部分无荧光或非常弱，为顶体完整且获能的精子； ③ AR型，整个精子头部无荧光，为顶体不完整的精子，即发生了顶体反应的精子。 ① ② ③ 顶体检测 精子顶体主要是应用PI 和FITC-PNA 联合标记，用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。 现在用的最多的是异硫氰酸荧光素（FITC）与花生凝集素（PNA）结合使用效果好。 A)PI标记死精子的细胞核呈现红色荧光； B)发生顶体反应或顶体膜破损的精子被FITC-PNA 标记，呈现绿色顶体。 荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态 A) B) 流式细胞仪检测精子的活力和顶体状态 Q1：PI 标记为未发生顶体反应死精子； Q2：PI/FITC-PNA 标记的顶体反应死精子； Q3：无颜色，未发生顶体反应活精子； Q4：FITC-PNA标记发生顶体反应活精子。 体外受精检测 更能够接近体 内的受精过程 更好的检测精 子的真实质量 部分动物体外受 精技术并不成熟 费时费力 实验条件复杂 成本过高 优点 缺点 卵母细胞体外受精(IVF) 技术已经很成熟， 可以利用IVF技术来检测精子的受精能力。 实验室评估精子质量与受精能力的关系 受精能力 膜 IVF 顶体 HZA 活力 活力与受精能力之间具有可变的相关性。 r = 0.15~0.83 （Kjaestad et al.,1993；Januskauskas et al.,2003） 膜的完整性与受精能力之间具有显著但可变的相关性 r = 0.05（Alm et al.,2001）； r =