黄色短杆菌三重抗药株的选育及其谷氨酰胺发酵条件的研究.pdfVIP

维普资讯 16．№ ．4 Dec．1993 第 ¨ 吣 9 卷q 第 日 黄色短杆菌三重抗药株的选育及其 4 期 谷氨酰胺发酵条件的研究 一 m a 王福 源 陈振风 王 绵华 王妙 虎 1 z2、＼ L 铀 — — — 工程 系 海 a 【提要】 本文介绍TSG 、8一AG 、MS0 三重抗性株 的选 育 方 法 厦 该 茵在 利 U l5L发酵罐上的发酵结果．结果表 明；新茵林不仅产谷氨酰胺能力比 出发 菌株提 n V 高 3O％，而且发酵液 中不 出现 离子交换柱层析行为与谷氨酰胺十分相 似 的杂 氨基 技 酸， 因此给 分离提取工作带来稂大方便． y 大 S 关键词：釜垂苎壁；选择互翌；昔色短杆菌；甲硫氨酸亚矾 醣 中圈法分类号tQ93．97 学 ∞ 选育优 良菌株是从事微生物发酵研究中的一项经常性工作．物理诱变和化学诱变法，至 学 a 今仍是主要的育种方法．如何提高获得优 良菌株的几率和选择能满足新菌株 特 性 的发酵 条 d 件，仍是一个重要的研究课题． 报 谷氨酰胺的发酵有一定难度 ．首先是不易得到高产谷氨酰胺的优 良菌株，其次皂发酵条 。 件对发酵结果的影响远比谷氢酸发酵明显，发酵条件控制较为严格．本文将介绍怍者在诱变 V 处y理技术及发酵罐发酵条件方面的一些研究结果． O 1 材 料 1．1 菌种 黄色短杆菌 Brevibacteriumflavum 磺胺脒抗性变异株 8920株． 1．2 试剂 ① 亚硝基胍 NTG ：SIGMA公司产品；② 硫酸二 乙酯 DES ：国产，化学纯j⑧ 8 t ． 氨乌嘌呤 8一AG ：SIGMA公司产品，④甲疏氨酸亚砜 MSO ：日本和光纯药工业会社产 品；⑤其他试剂 ：国产，分析纯或化学纯 ． 1．3 培养基 ① 种子培养基 ；酵母膏 1，蛋白脒 1，氯化铂 0．5，葡 萄糖 0．5，ptt7．0．③ 发酵 培养壁 ：葡萄糖 12，硫酸铵 8，玉米浆 1．2，KH PO ·3H O0．025，MgSO ·7HzO O．04，碳酸钙 5，维生鬃 I ．100 g，ptI7．： ③ 发酵罐培养基：在上述摇瓶发酵培养基组分 收 稿 口期 ： 19g3 ¨ ?1 ～ 434～ 维普资讯 中去隐维生素B 和碳酸钙，并，¨水解糖代替葡萄糖，其他成分和用置不变．③ 含药培养基 平板 t葡萄糖 2，硫酸铵 1，尿素 O．2，KI PO．·3 1O O．3，MgSO．·7HzO 0．1， 维生素 B l0p．g琼脂 2，生物素 05p．g，FeSO ·7H O 0，O01，pH 70．在上述成分中按 需分别加入不 同量的药物． 2 方 法 2．1 谷氨醺胺 Gin 测定 用纸层析将样品液展开，显色后将斑点冼脱，洗脱液在 52Onil3下测 OD 值，然后从标 准曲线上查得谷氨酰胺量． 2．2 育种和发酵水平考察 对出发菌株细胞进行化学诱变处理，接着在含药平板上挑选菌落，然后经摇管试验和摇 瓶试验选出优良菌株，最后在 15L小型发酵罐上进行发酵试验，从发酵周期 耗糖 速 率 和 产谷氨酰胺水平等方面加 以考察． 2．3 发醇试验 ①发酵培养基组成：葡萄糖浓度 固定为 l2 ，然后通过正交法对培养基的几种主要成分 的用量加以确定． 。 ②摇管试验和摇瓶试验：在 37mL试管中加入 3mL发酵培养基，500mL三角烧 瓶 中 加入 30mL发酵培养基，灭菌后按 0．4 种量接种，32℃ 连续振 荡培养 52h．摇床 振 幅 6cm，每 mJn往复 135次 ． ③发酵罐试验：在 ]5L发酵罐中装入 19L发酵液，灭菌后按 O．4 种量 接 种．发 酵 温度 32℃．转速 650r／rain，通风 3L．发酵前期pH值维持在 7．0，发酵中、后 期维 持在 5．8．发酵过程中用碱液维持 PH 值． 3 结果和讨论 3．1 诱变处理技术 出发菌株选择是否合适，直接影响菌种选育效果．根据作者多年经验，野生菌株的诱变 处理效果比较明显，新菌株的谷氨酰胺生成量有明显提高．但随着诱变处理次数增加，谷氨 酰胺生成量很难进一步提高，而且诱变处理后得到的变异株中负突变株占相当部分．因此， 选择怎样的变异株作为诱变用的出发菌株，显得十分重要．作者认为：以产谷氨酰胺能力为 中等水平、且在发酵特性 上尚有欠缺之处的菌株为诱变用出发菌株较妥当．在本实验中使用 的出发菌株，它有一定的产谷氨酰胺能力 20mg／mL ，且发酵液中含有一种跟谷氨酰胺离 子交换柱层析行为十分相似的氨基酸，从这种发酵液中分离提取谷氨酰胺有一定难度 ．由出 发菌株 8920株得到的变异株 9373株，其产谷氧酰胺能力有