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研究背景 研究意义 技术路线 可行性研究 工作小结 后续研究 一、研究背景 细菌性青枯病分布和危害 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的毁灭性土传病害，主要分布在热带、亚热带和温带地区，在我国南方各省市均有严重发生。青枯雷尔氏菌可危害44个科的300余种植物。 一、研究背景 青枯雷尔氏菌形态特征 菌体形态 呈长椭圆形，近杆状，革兰氏阴性菌，菌体大小为0.5-0.8×1.3-2.2微米，极生鞭毛1-4根，不形成荚膜和芽孢。菌体内均有聚-β-羟基丁酸盐颗粒，在电子显微镜或显微镜下显示两极着色较深的特征。 一、研究背景 一、研究背景 青枯雷尔氏菌检测和鉴定 一、研究背景 青枯雷尔氏菌致病性机制 二、研究意义 三、技术路线 四、可行性研究 张扬等设计了适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系，并成功克隆了编码青枯菌12个gsp基因。 2002年法国科学家Salanoubat等在自然杂志上发表了青枯菌(GMI1000菌株)的全基因组序列。在GenBank登录号为AL646052。 五、工作小结 青枯雷尔氏菌鉴定 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 五、工作小结 六、后续研究 青枯雷尔氏菌致病性检测及相关基因分析 汇报人 ：林海云 指导教师：刘波、关雄、车建美 汇报内容 青枯雷尔氏菌分类地位 Kingdom：Bacteria Phylum：Proteobacteria Class：BetaProteobacteria Oder：Burkholderiales Family：Burkholderiaceae Genius：Ralstonia 青枯雷尔氏菌形态特征 菌落形态 在TTC培养基上，在30℃下划线培养48~72h后，可出现两种菌落形态。 检测方法 分子 生物学 血清学 传统组织 分离 半选择性培养基 四氮唑培养基 酶联免疫吸附法 间接免疫荧光染色法 PCR扩增技术 分子杂交检测法 胞外多糖（EPSI） 堵塞导管，导致导管破裂；移动、扩散和定植；掩盖脂多糖。 胞外蛋白—— 10种左右，95％ 果胶酶，将果胶质肢解成低聚物并为病菌提供半乳糖醛酸作为生长基质；纤维素酶，通过降解细胞壁上的纤维性葡萄糖，可能对青枯菌入侵植物根部和穿越木质部导管起着一定的作用 Ⅲ型分泌系统及其输出产物(T3S)——hrp基因簇 对细菌搬运毒性因子或非毒性蛋白直接进入植物细胞，促进病原细菌获得营养或抑制寄主防御反应起着作用。 从分子水平揭示青枯雷尔氏菌在致病性的差异 找出致病性基因中引起致弱的关键基因 提供青枯雷尔氏菌致病性强弱检测新途径 提供药物作用靶标位点，为设计新型药物提供依据 对比 回接植物 观察致病力 胞外多糖 检测 pH 检测 生长曲线 绘制 菌株筛选 弱化指数测定 特异性引物鉴定菌株 筛选引物，致病性基因检测 生理、生化检测 Poussier. S 等用Oligo 5.0软件，设计了11对引物对hrp基因簇整段序列的扩增，并且片段长度从231到2456_bp。 30℃ 170rmp/min 14~16h 30℃，48~72h 待鉴定菌株 SPA 培养基 四氮唑培养基 划线 PCR扩增 DNA 提取 摇瓶培养 特异性引物 Promega试剂盒 504bp 纯度检测 方法： 形态鉴定 分子鉴定 青枯雷尔氏菌鉴定 强致病性青枯雷尔氏菌 非青枯雷尔氏菌 弱致病性青枯雷尔氏菌 不同寄主青枯雷尔氏菌DNA浓度测定结果 不同寄主青枯雷尔氏菌DNA频数分布图 非参数分析结果如下：Chi-Square=254.750，df=85，Sig=0.00，说明不同菌株间DNA浓度有极显著的差异，因此有必要对其统一标准化，进行统一换算，以减少后续试验的误差。所以对所提取的DNA换算为终浓度为25ng/μL。 青枯雷尔氏菌基因组DNA提取 青枯雷尔氏菌的分子鉴定 504bp 504bp 504bp 504bp 共完成109菌株鉴定，其中85株已鉴定为青枯雷尔氏菌。 提取了85株青枯雷尔氏菌DNA，并将其浓度