沉淀反应㈠.pptVIP

第四次实验沉淀反应（一） 一、双相免疫扩散试验㈠ 原理 ㈡应用 ㈢方法 二、对流免疫电泳㈠ 原理 ㈡ 方法 实验报告 * * 沉淀反应（precipitation）——指可溶性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物或沉淀线的现象。 液体内沉淀试验 凝胶内沉淀试验 凝胶免疫电泳技术 免疫浊度测定 絮状沉淀试验 单相琼脂扩散试验 双相琼脂扩散试验 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 免疫固定电泳 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。 可在玻片或平板上进行，分为单相、双相两种基本型。 凝胶内沉淀试验 将抗原、抗体分别加在琼脂糖凝胶对应的孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。 1、抗原或抗体的存在与 否以及相对含量的估计 2、抗原或抗体相对分子 量的估计 3、抗原性质的相互关系分析 吻合-相同 相交-完全不同 相切-部分相同 4、抗体效价的滴定 5、抗原或抗体纯度 的分析 单一抗原抗体系统 多个抗原抗体系统 以出现沉淀线的抗体最高稀释度为效价 Ag1 Ab1 Ag1、2、3、4、5 Ab1、2、3、4、5 1、制板：1%生理盐水琼脂加热融化，约4ml/块。 2、打孔：琼脂凝固后，用打孔器打梅花孔，挑去孔中琼脂。 3、加样：用微量加样器加样，12μl/孔。⑴ 定性；⑵ 定量。(不可溢出或有气泡） 4、温育：作好标记，放入湿盒，置37℃温箱24小时后，取出观察结果。 1 4 6 5 2 3 ⑴ 定性 ⑵ 定量 中央孔：AFP诊断血清 1、4孔：AFP阳性血清 2、3孔：甲待检血清 5、6孔：乙待检血清 中央孔：IgG 1~6孔：不同稀释度的抗IgG 1 4 6 5 2 3 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 ⑴ 定性 ⑵ 定量 结论：抗IgG的效价是？ 1 4 6 5 2 3 1 4 6 5 2 3 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 结论：待检血清甲中？ 待检血清乙中？ 结果 双相免疫扩散＋电泳 1、加快反应的速度 2、提高了灵敏度 优点 移动速度：胶体颗粒所带电荷量的多少、分子量的大小 电泳：指带电胶体颗粒在电场中的运动。 移动方向：胶体颗粒所带电荷 胶体颗粒所带电荷：胶体颗粒的等电点（PI）、缓冲液的pH值 PI＜pH PI＞pH →正极 →负极 电荷多、分子量小则速度快 Ab Ag ＋ － 巴比妥缓冲液： pH 8.6 Ag：PI 4~5，分子量较小 Ab：PI 6~7，分子量较大 ＋ ＋ 沉淀线位置？ 电场力 用琼脂凝胶电泳时，琼脂带有负电荷，但琼脂是固相，不能移动，所以使液相部分向相反方向（阴极）运动。 电渗：在电场中，液相对于固定不动的固体作相对移动。 Ag所带负电荷多，分子量较小，作用于Ag 电场力＞电渗力 Ab所带负电荷少，分子量较大，作用于Ab 电渗力＞电场力 ＋ － 1、制板：1%巴比妥缓冲琼脂，约4ml/块。 2、打孔：琼脂凝固后，用打孔器打双排孔，挑去孔中琼脂。 3、加样：用微量加样器加样，12μl/孔。 4、电泳：抗体孔置于正极端，抗原孔置于负极端。电泳40分钟，观察结果。 ＋ － 标记孔 AFP诊断血清 待检血清 AFP阳性血清 电压4～6V/cm（玻片长度7.5cm ），本次实验所用电压为40～45V 电流3～4mA/cm（玻片宽度2.5cm ），所需电流的毫安数=放入电泳槽中缓冲琼脂板总数×玻片宽度×3～4mA ＋ ＋ － － ＋ － 标记孔 AFP诊断血清 待检血清 AFP阳性血清 ? 结果：图示结果 结论：待检血清中有/无AFP？ * * *