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HSP90在离体人真皮成纤维细胞热损伤中的保护作用 　　作者：李德全,黄晓元,龙剑虹,杨兴华　　作者单位：中南大学湘雅医院烧伤整形科，湖南 长沙 410008 　　【摘要】目的： 探讨人真皮成纤维细胞热损伤变性后HSP90的保护作用. 方法：培养的人真皮成纤维细胞在52℃，30 s热水损伤24 h后用免疫荧光观察HSP90表达部位的改变并与正常组比较，用Western Blot 进一步分析正常的FB和热变性的FB在3, 6, 12, 24, 48, 72, 96及120 h时相点HSP90表达量的改变. 结果：用免疫荧光观察到FB热损伤后24 h胞质胞核中出现HSP90高表达. Western Blot显示3 h即有HSP90表达量升高，24 h达到高峰，维持到96 h，120 h恢复到正常. 结果： FB热变性可以引起HSP90异常高表达，HSP90对FB热损伤具有保护作用. 　　【关键词】 成纤维细胞;热损伤;热休克蛋白质90;保护 　　0引言 　　成纤维细胞(fibroblast, FB)是创面修复的主要细胞[1]，在实验中我们发现FB受到热损伤后经过一段时间可以完全恢复. 热休克蛋白90(heat shock proteins, HSP90)是广泛存在于真核和原核细胞中的分子侣伴，在蛋白的修复、信号传导中发挥重要作用[2-3]. 但HSP90在FB热损伤后整个恢复过程中的变化却少见报道，本研究以烫伤成纤维细胞为实验模型，结合免疫荧光和免疫印迹深入分析FB损伤后不同时间内HSP90水平表达变化，为临床治疗提供理论依据. 　　1材料和方法 　　1.1材料5 g/L胰旦白酶+0.2 g/L乙二胺四乙(EDTA),DMEM，新生小牛血清，载玻片 20 mL/L小牛血清封闭液，1∶25山羊HSP90一抗(Santa cruz，美国)，FITC标记免抗山羊IgG(H+L) (二抗,武汉博士德)，5 mL/L TritonX 100打孔液，CeLLpticTM ceLL Lysis Reagent (Sigma)，蛋白Marker，马抗人Βactin一抗 (Santa cruz，美国)，山羊抗马Βactin二抗(Santa cruz，美国). 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养取门诊手术切除的小儿包皮,用生理盐水清洗3次，10 g/L碘伏浸泡5 min，再用生理盐水清洗3次，在含有青霉素(1000万U/L)的生理盐水中剪除皮下脂肪组织和筋膜，将分离后皮肤转移到5 mL锥形瓶中剪成糊状，加入2.5 mL 5 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L乙二胺四乙(EDTA),在37℃，1000 r/min恒温器下振荡1.5 h，加含100 mL/L FCS的DMEM 2.5 mL中和胰酶，用100目金筛网过滤，过滤液经1000 g离心10 min，收集细胞，以1×108/L接种于75 mL玻璃培养瓶中， 37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养. 24 h后倒置显微镜观察有部分细胞贴壁，更换细胞培养液，更换下来的培养液重新离心获取细胞培养，前3 d每日换液，以后视细胞生长情况3～5 d换液一次，3～4 wk左右可见细胞贴满瓶底，取第5～15代细胞做实验用. 　　1.2.2人皮肤成纤维细胞热损伤反应当细胞生长融合达80%时，用5 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L乙二胺四乙(EDTA)消化，配成2×108/L细胞悬液，分为正常组和实验组，每培养瓶中的细胞悬液为4 mL. 正常组培养瓶浸入37℃液平面下30 s，实验组则在52℃浴水中浸泡30 s形成热损伤变性，分别于3，12，24，48，72，96，120 h为时相点收集细胞进行检测，实验重复3次. 　　1.2.3HSP90免疫组织化学荧光检测将正常组和实验组FB分别倒入置有载玻片的六孔培养板中，置于37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养1 d，按常规方法进行免疫细胞化学染色，HSP90一抗，FITC标记免疫为二抗，阴性对照用0.01 mmoL/S PBS代替一抗，其余步骤不变. 　　1.2.4HSP 90 Western Blot 分析首先提取FB中总蛋白，按BCATM Protein Assay kit(Pierce) 说明测定蛋白质浓度，分装后将其置于-70℃待用. 每个样品取30 Μg蛋白质加入等体积3×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃煮沸5 min，经100 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后，100 V电转移PVDF膜1.5 h，20 g/L BSA室温封闭4 h,加入1∶2000稀释HSP90一抗(Santa cruz, 美国)，4℃过夜，PBST洗膜，加1∶3000稀释生物素标记二抗(武汉博士德