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应用mRNA差异显示技术克蘸新的肝癌槽关基西 应用mRNA差异显示技术克隆新的肝癌相关基因 王征旭曾锦章洪敷王红阳昊孟超 肝癌的发生、发展目前认为亦是多因素参与的复杂过程，寻找肝癌差异表达基因，并确定 其在肝癌发生、发展中的作用，对肝癌的诊断、蓣防和治疗均具有重大意义[1J。我们利用mR． chaill NA差异显示技术(differentialpolymerase display 癌组织中高表达，癌旁组织中不表达或低表达的基因片段，报告如下。 材料与方法 1．肝癌标本厦主要材料12对肝细胞癌、癌旁组织为我院近期切除的手术标本，液氯中 保存。pGEM-TEasy RnaseH-Re- DNA Kit购自GIBCⅪ公司o v㈣Transeriptse Taq Bioteeh。同位索口卫P．dA砰(10mCi／m1)购自北京亚辉生物医学工程公司。 (arbitary 先94℃4min变性，然后在下列条件下进行40个循环：93℃lmin，40C2rain，70℃lmin20s， 最后于72℃延伸8min，热启动。 3．差异片段的回收、扩增、再证实和克隆用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异片 段，电泳结束后凝胶直接．80℃放射白显影10h，对照x线片，切下有差异的凝胶条带，加入相 GelEx- 对应的一对PCR引物再扩增。扩增产物用琼脂糖片段纯化、回收试剂盒QIAquick tract 本肝癌、癌旁组织进行Northernblot。杂交阳性者再与得到该片段的6％变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳结果进行比较(应一致，同时来源于癌或癌旁组织)，以进一步去除假阳性。杂交阳性的片 选重组克隆，在确定菌落内含有目的基因片段后，培养细菌，快速提取质粒DNA。 中国人类基因组计划课题贷助 作者单位：200438上海，第二军医大学东方肝胆外科医院 中国癌症研究进展@ 的No．hem印迹杂交方法，对该基因在12对肝癌、癌旁组织中的表达情况进行分析，杂交结 果用FLA-2000富士荧光及射线影像分析仪进行分析： RNA杂交强度 瘴堑塑苤童盘堂堑廑堡缝塑堡坠坠生{竖亟速篓冀蒌摩筵： 癌旁组织杂交条带灰度值／癌旁组织RNA中18S电泳条带灰度值 结 果 1．RNA差异显示结果我们使用 5条上游引物、4条下游引物，从两对肝 癌、癌旁组织中回收了百余条差异表达 的聚丙烯酰胺凝胶条带，对其中的部分 条带进行2次PCR扩增、纯化和North- ∞杂交。结果仅50％左右的纯化片段 与源标本能够相杂交，且杂交结果与得 到该片段的6％变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳结果一致，假阳性率50％。 2．核酸序列分析及同源