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pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖 和凋亡研究 张梅英1徐影琪1王惟1赵越1杨葳1于萌1郭晓冲1秦英1郑志红1,2 1中国医科大学实验动物部，沈阳，110001 2中国医科大学病理学与病理生理学研究室，沈阳，110001 [摘要]目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体， 为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法 采用突变试 剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变，分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体，并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞， 500μg/mLG418压力筛选稳定克隆，对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴 定，采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检 测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418 筛选后，PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆，RT-PCR及westernblot方法进行DJ-l-His 基因表达检测，结果均证明外源插入基因的表达，MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的 NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组 (P＜0.05)，转染DJ-1基因的NIH3T3 阳性细胞细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别；细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因 的NIH3T3阳性细胞细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞，转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞细胞凋 亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05)。结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-l和 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达质载体，成功筛选出稳定表达DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞。 DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡。 [关键词]DJ-1;NIH3T3细胞；帕金森；凋亡 ConstructionofExpressionVectorpcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26IandStudyofits ImpactiononCellProliferationandApoptosisinNIH3T3Cells ZhANGMei-ying,1XUYing-qi1WANGWei1ZHAOYue1YANGWei1YUMeng1GUOXiao-chong1 QINYing1ZHENGZhi-hong1,2 1LaboratoryAnimalCenter,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China 2DepartmentofPathologyandPathophysiologyResearch,ChinaMedicalUniversity,110001,China [Abstract] ObjectiveToconstructtherecombinantexpressionvectorsofpcDNA3.1/myc-His-DJ-1 andpcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I,andprovidabasisforfurtherstudyontherelationshipofDJ-1M26I mutationandcellproliferationandapoptosisandestablishtransgenicanimalmodel.MethodsUsing site-directedmutagenesiskittomakethe26thaminoacidmutated,constructedpcDNA3.1/myc-His-DJ-1 andpcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26Irecombinantexpressionvectors.Andthentransfectedtheminto NIH3T3cellsrespectivelyusinglipofectamine.Cellswereselectedwi