Trametes+hirsuta+lg-9漆酶的纯化与性质研究.pdfVIP

第二届中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集 2007．07．15．18威海 Trameteshirsuta lg一9漆酶的纯化和性质研究 张海波黄峰+ 山东大学微生物技术国家重点实验室，济南，250100 摘要：从本实验室菌种库百余种菌株中通过Bavendamm反应以及生长量的变化筛选出 四株抗逆性较强，具有较高漆酶产量的菌株，并分别通过菌丝、子实体、孢子形态学以 hirsuta 及分子生物学(ITS)方法进行了鉴定。液体发酵试验进一步检测证明Trameteslg．9 具有较高的生长活性和产漆酶能力，以飚rk改良培养基通过正交试验[L16(152)]分析法对 hirsuta 影响Trameteslg．9漆酶产量的因素进行分析得出：碳源等因素是该菌株的主要影 FF、 响因素，碳源和氮源之间存在相互影响作用。用超滤、硫酸铵沉淀、DEAE．Sepharose hirsuta S．200等对Trametes Sephacryyl lg．9漆酶进行纯化，通过SDS检测，达到电泳 纯水平。SDS．page电泳结果表明该漆酶单体分子量约为5．5kD左右。该漆酶的最适反应 在2．5左右，对于2，6．DMP的Km值约为0．616mM。 hirsuta 关键词：Trameteslg·9漆酶纯化性质 漆酶(ECl．10．3．2， p．苯二酚：氧气氧化还原酶)属于多铜氧化酶家族中的一大 类，是一种糖蛋白，它能够在氧气作为电子供体的情况下氧化芳香族化合物。漆酶最早 由日本人Yoshida(1883)发现于植物漆树(Rhus (1985)年首次鉴定漆酶为一种金属蛋白，每个单体中含有四个铜离子。漆酶是一种四 左右。漆酶能够利用氧气作为电子供体氧化芳香族的化合物成为二氧化碳和水，因此漆 酶在生物炼制、纸浆漂白和改性、造纸污水处理、印染污水处理、食品加工业以及有机 合成当中都有很好的应用前景。漆酶的分布非常广泛，在动物【l】、植物121、真菌、细菌【3】 当中都有发现，其中真菌中的漆酶是当前人们研究的热点14J。 1材料和方法 1．1试验菌株和仪器 本实验室真菌菌种库：采于济南周围、蒙山、泰山、九寨沟以及购于中国科学院微 s．20 Fastflow、DYY-5型稳 生物研究所。SephacrylHighResolution、DEAE．Sepharose 集分析仪等。 1．2酶活性测定方法 2，6-DMP法： 酶活力定义为lmin内吸光度的变化15J。 ABTS法： AB H=4． 反应体系：2mL反应液含2mL溶有1mmol TS的0．1mmol／L醋酸缓冲液(p 化底物(AaTS)弓I起吸光值的增加量为一个酶活单位㈣怕J。 1．3菌株筛选及鉴定 菌株筛选初筛是通过Bavendamm反应进行的。通过对本实验室保存的菌株进行显 色培养挑选出生长速度快、变色深的菌株。菌株的鉴定是依照传统的形态学分类方法和 分子生物学方法进行的。形态学方法主要包括子实体形态、孢子形态以及菌丝体形态； 第=局中同资源生物拄术与耱I程学术讨会论文集700707I5-18硪海 分予生物学手段是利用5 的不保守性柬进行分类的。对经过初筛的菌株进行了液体发酵试验进行进一步的验证进 行进一步的筛选。 1 4Trameteshirsuta lg．9漆酶产酶影响因素的分析 影响漆酶胞外分泌量的因素很多