H1亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立.pdfVIP

动物医学进展 ，2013，34(7)：29—34 ProgressinVeterinaryM edicine H1亚型禽流感病毒实时荧光定量 PCR检测方法的建立 郭 捷 ，谢芝勋 ，罗思思 ，刘加波 ，邓显文 ，谢志勤 ，庞耀珊 ，范 晴 (1．广西大学动物科技学院，广西南宁 530004；2．广西兽医研究所 ，广西疫苗新技术重点实验室，广西南宁 530001) 摘 要：本研究旨在建立一种检测H1亚型禽流感病毒 (AIV)的SYBRGreenI实时荧光定量PCR方 法。根据对 GenBank中H1亚型AIVHA基 因序列的分析，设计针对 H1亚型 AIV的 HA基 因特异性 引 物 ，并以H1亚型AIV 的cDNA为模版，构建重组阳性质粒。采用梯度稀释重组标准品阳性质粒DNA的方 法 ，建立SYBRGreen工实时荧光定量PCR(real-timePCR)标准曲线。敏感性试验结果显示 ，扩增效率和标 准误差分别为 100．9 和0．0117，熔解曲线呈单一熔解峰。在 35个Ct值 内该方法可检测到 100个拷贝的 标准品DNA；特异性试验结果显示，该方法对于其他亚型AIV和禽呼吸道病原体不能检 出；重复性试验结 果显示，组 内变异系数小于 1 。建立的Real—timePCR具有特异 、敏感、快速、重复性好等优点，可用于临床 上 H1亚 型 AIV 的检 测 。 关键词 ：H1亚型AIV；SYBRGreen工；实时荧光定量 PCR 中图分类号：Q789；$852．659．5 文献标识码 ：A 文章编号：1007—5038(2013)07—0029—06 由禽流感病毒 (Avianinfluenzavirus，AIV)引 义[3。]。由于 AIV—HA基因和 NA基 因分型排歹U出 起 的禽流行性感 冒，简称为禽流感 (Avianinfluenza， 血清亚型众多，并且各血清型之间的交叉反应性很 AI)，其以感染禽类为主 ，AIV属于正黏病毒科 (Or— 低 ，很容易在各个亚型之 间发生之前所说的基因重 thomyxoviridae)A 型流感病毒属 的流感病毒__1]。 组与突变现象，有将弱病毒株转为强病毒株 的风险， AIV作为单链 RNA病毒，因为其依赖 的RNA聚合 从而给禽流感病毒在诊断和预防方面带来了非常大 酶缺乏矫正功能而 比DNA病毒 的突变率高，所 以 的难度 。因此 ，有必要建立快速特异 的检测技 抗原基 因最常出现 由于点突变引起的抗原飘移和基 术加强对 HI亚型AIV的病原学检测工作。 因重排的抗原转变。但是也有报道证实 AIV 同样 实时荧光定量 PCR(Real—timePCR)技术 1996 能够感染除禽类 以外 的动物 ，如猪、海洋类哺乳动物 年在美 国推 出，因其具有特异性更强 、有 效解 决 及人类等[2]，受到了越来越多的重视 。可 以根据其 PCR污染问题 、自动化程度高等特点_1，目前得 到 表面糖蛋 白血凝素 (HA)和神经氨酸酶 (NA)抗原 广泛应用 ，已成为很多病原体检测的重要方法r1]。 性 的差异对 AIV进行分 型，目前共发现 16个 HA 本研究采用 SYBRGreenI荧光染料技术 ，该染料 亚型和 9个 NA亚型_】]。另外 ，根据 临床症状可将 是一种能非特异 的渗入 DNA双螺旋小沟区域发 出 禽流感分为高致病性禽流感和低致病性禽流感 ，其 具有绿色激发波长的染料 ，形成荧光信号 ，通过对荧 中人们所熟知的是 H5和 H7亚型AIV可引起高致 光强度 的检测达到实时监测 PCR产物量 的效果 。 病性禽流感 ，造成禽类 的高发病率和病死率 。研究 而未掺入链 中的染料分子不会发射任何荧光信号 ， 发现，H1亚型 AIV虽然属于低致病性禽流感病毒 ， 继而保证荧光信号的增加与 PCR产物 的增加完全 感染禽类没有明显 的临床表现 ，却在人类流感病毒 同步。整个反应操作简单 ，快速 ，尤其适用于 AIV 发展史上有着不可忽视的作用 。全球性的流感大流 感染的早期检测和筛选。 行中，H1亚 型 AIV起主导作用。越来越多的研究 1 材料与方法 表