cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta（DE3）中的表达.pdfVIP

安徽农业科学，JournalofAnhuiAgri．Sci2012，40(2)：648—651 责任编辑 朱琼琼 责任校对 李岩 cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌 Rosetta(DE3)中的表达 罗翠平，李金华，谢烨明，曾万勇 (武汉工业学院，湖北武汉43】【(】23) 摘要 [目的]对cry基 因保守序列进行克隆，并使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据NCBI数据库信息设计引物序 列，采用PCR技术从抗虫棉基因组DNA中扩增 出抗虫基因cry的保守序列，构建重组载体并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株 中，利用 pGEX原核表达系统诱导蛋白表达。同时，分析了不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。 结果]扩增 出抗虫基因cry的 两段保守序列 ，长度分别为304和853bp；SDS检测结果显示，经 IPTG诱导后重组质粒pGEX-4t一1．304和pGEX4t—l一853成功地表 达了大量GsT融合蛋白，分子量分别为39和62．4kDa，与预期结果一致；确定了IPTG最佳诱导浓度为0．15mmol／L，最佳诱导时间为7 h。J结论 l为今后检测转Bt基因农作物奠定了基础。 关键词 ＆基 因；保守序列；克隆；原核表达 中图分类号 $481．9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2012)02—00648—40 CloningandExpressionofConservedSequencesofcry-typeGeneinRosetta(DE3) LUO Cni-pingetal fWuhanPolytechnicUniversityWuhan4300231 Abstract [Objective]rrheaimwastocloneandexpresstheconservedsequenceofcry—typegeneinRosetta(DE3)．[Method] opairsofspe— cialprimersweredesignedaccordingtoNCBIdatabaseinformationandtheconservedsequencesofcry—typegenewasamplifiedbyPCRfromBt transgeniccotton．ThenrecombinantplasmidshavebeenconstructedandexpressedinEscherichiacolRosetta(DE3)strain．Andtheeffectofdif- ferentconcentrationandinducingtimeofIPI1G ontheexpressionproductwasanalyzed．ResultlTwoconservedsequencesofcry—typegenewere amplifiedandthelengthofthem was3o4and853bprespectively，TheresultofSDS—PAGE confirmedthattherecombinantplasmidspGEX-4t．1． 340 andpGEX-4tl一853whichinducedbyIPrrG couldexpressfusionproteinsandthemolecularweightwas39and62．4kDarespectively．which wasinaceordancewithpredictedresults．Thenabetterprotein expression conditionswereconfirmedthattheconcentrationofIm was0．15 mmo1／Landtheinducingtimewas7hours．1ConclusionIItpreparedthegroundforthefurtherdetectionofBttransgeniccrop． Keywords Btgene；Conservedsequence；Cloning；Prokaryotieexpression 苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种具有杀虫 长 10％，其中 抗虫转基因作物为2630万公顷，相对2009 活性的革兰氏阳性土壤芽孢杆菌0。Bt杀虫活性源于形成 年增长21％，占全球转基因作物种植总面积的 17％。转基 芽孢时产生的杀虫结晶