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大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法标准发展报告

DevelopmentReportonQuarantineandIdentificationMethodsforSoybeanStemCankerPathogen

摘要

大豆南方茎溃疡病是由病原真菌*Diaporthephaseolorum*引起的毁灭性病害，自1973年在美国首次发现后，迅速蔓延至北美和南美主要大豆产区，造成严重产量损失，局部地区损失率高达100%。该病害可通过受侵染的种子及植物残体随国际贸易传播，对我国大豆产业构成重大生物安全威胁。近年来，我国海关在进口大豆中多次截获该病原菌，凸显了建立高效检疫鉴定体系的紧迫性。

本报告系统分析了大豆茎溃疡病菌检疫鉴定标准的立项背景、技术需求及创新内容。现行行业标准主要依赖形态学鉴定和分子测序，检测周期长、效率低。为应对这一挑战，中国检验检疫科学研究院于2021年启动快速检测技术研发，将RPA荧光法、试纸条法等分子检测新技术纳入“十四五”生物安全重点专项，显著提升了检测的精准性与时效性。本报告详细阐述了标准中涉及的分离培养、形态学鉴定、多重分子检测方法（常规PCR、实时荧光PCR、RPA技术）及判定标准，明确了其在口岸检疫和田间监测中的应用范围。研究结果表明，新标准通过整合多技术平台，可实现病原菌的快速、精准鉴定，为大豆产业链安全提供关键技术支撑。

关键词

大豆茎溃疡病菌；检疫鉴定；实时荧光PCR；RPA技术；生物安全

SoybeanStemCankerPathogen;QuarantineIdentification;Real-timePCR;RPATechnology;Biosafety

正文

1.立项目的与意义

大豆南方茎溃疡病是一种全球性病害，其病原菌*Diaporthephaseolorum*侵染性强，可在大豆各生长阶段引发系统性症状。受侵染植株茎部形成红褐色溃疡斑，表皮剥落，维管组织坏死，导致植株倒伏和绝收。种子受侵染后表现为皱缩、白垩化，显著降低发芽率和商品价值。该病害于20世纪70年代在美国南部暴发，随后扩散至巴西、阿根廷等主产国，成为美洲大豆生产的主要限制因素之一。

我国作为全球最大的大豆进口国，年均进口量超过1亿吨，面临较高的外来病原入侵风险。海关总署历年监测数据显示，多批次进口大豆中检出茎溃疡病菌，需通过技术手段阻断其传播。然而，现行行业标准（如SN/T1842-2006）仅涵盖形态学观察和基因测序，操作繁琐且耗时长，难以满足口岸快速通关与田间实时监测需求。

为突破技术瓶颈，中国检科院在“十四五”生物安全专项支持下，研发了基于重组酶聚合酶扩增（RPA）的荧光与试纸条检测方法，可在20分钟内完成病原鉴定，灵敏度较传统方法提升10倍以上。新标准的制定将统一检疫程序，降低漏检风险，对保障我国粮食安全和农业生物安全具有重大战略意义。

2.范围与主要技术内容

本标准规定了大豆南方茎溃疡病菌的分离培养、形态学鉴定及分子生物学检测方法，适用于出入境口岸、大豆产区及种子企业的病原筛查与监测。

2.1样品预处理与分离培养

优先选取干瘪、畸形或携带病斑的种子及植物残体，经1%次氯酸钠表面消毒5分钟后，于25℃条件下保湿培养或接种于APDA培养基，诱导病原菌生长。

2.2形态学鉴定

通过显微观察菌落形态、子囊壳结构及孢子特征进行初步鉴定：

-菌落特征：菌丝体白色平展，产生褐色厚垣孢子。

-子囊壳：黑色球形，直径165–412μm，喙部长度24–518μm。

-子囊孢子：透明双细胞，长圆形至椭圆形，大小8–12×3–4μm。

-无性阶段：拟茎点霉仅产生α型分生孢子，梭形，含两端油滴，大小约2.1×5.2μm。

2.3分子生物学鉴定

DNA提取：采用CTAB法或商业植物基因组试剂盒。

检测方法：

1.常规PCR：使用引物DPMF3/DPMR2，扩增产物270bp。

2.实时荧光PCR：采用引物DM1F/DM1R与探针DM1Pb，Ct值≤35为阳性，≥40为阴性，35–40间需复测。

3.RPA荧光法：引物DmRPAF-F/DmRPAF-R与探针DmRPAF-P，20分钟内出现扩增曲线判定为阳性。

4.RPA试纸条法：引物DmRPA-F/DmRPA-R与探针DmRPA-P，控制线与检测线均显色为阳性。

2.4综合判定

结合寄主症状（茎部溃疡斑、叶片褪绿）、形态特征及任一种分子检测阳性结果，可判定为大豆南方茎溃疡病菌。

主要参与单位介绍

中国检验检疫科学研究院作为本标准的核心研制单位，是国家市场监督管理总局直属的综合性科研机构，长期致力于动植物检疫、生物安全与标准化研究。该院拥有“国家生物安全检测重点实验室”和“国家级检疫处理技术中心”，在