分子生物学技术课件.pptVIP

分子生物學技術聚合酶鏈反應(PCR)PCR能夠對一個DNA分子上任何一段兩端序列已知的區域進行選擇性擴增。引物：依據已知的兩端序列合成的寡核苷酸單鏈。限定了將要被擴增的區域。Taq酶：從嗜熱水生菌(Thrmusaquaticus)中獲得的DNA聚合酶Ⅰ，在熱變性時不會失活。PCR反應步驟PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成①範本DNA變性：94℃時雙鏈範本DNA解離成單鏈②範本DNA與引物退火：溫度降至55℃左右時引物與範本DNA單鏈上的互補序列結合③引物的延伸：在引物的引導下，Taq酶以dNTP為原料，以靶序列為範本，按堿基配對與半保留複製原理合成一條與靶序列互補的複製鏈K.B.Mullis3‘5‘5‘3‘94℃變性退火3‘3‘5‘5‘將要被擴增的區域Taq酶和dNTP5‘5‘3‘3‘引物3‘3‘5‘5‘5‘3‘合成新鏈第二輪變性第二輪退火、延伸原始範本第一輪反應產物25-30輪反應PCR-SSCP技術1989年問世的PCR-SSCP(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)作為檢測基因突變的方法，經不斷地改進和完善，更為簡便、快速、靈敏，不但用於檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，而且還被用於DNA定量分析原理單鏈DNA片段————複雜的空間折疊構象當堿基改變時————構象發生改變因此，通過非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開，該方法為單鏈構象多態性，將SSCP用於檢查PCR擴增產物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP技術試驗程式與結果分析PCR產物單鏈電泳變性徹底（2條帶）變性不徹底(3條帶）如果與正常的對照相比，兩條單鏈形成的條帶位置有了改變，則表明有堿基突變存在。因此，要仔細設置對照，仔細分析出現的異常條帶則不難確定突變的存在。熱變性優點高檢測率，小於300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現不足之處（1）只能作為一種突變檢測方法，要最後確定突變的位置和類型，還需進一步測序（2）由於SSCP是依據點突變引起單鏈DNA分子立體構象的改變來實現電泳分離的，這樣就可能會出現當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小時，再加上其他條件的影響，使聚丙烯醯胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢PCR-SSCP技術應用該方法大量地用於檢測和腫瘤發生有關的基因突變，例如檢測星形細胞瘤、腦瘤、小細胞肺癌、胃癌、腸癌等腫瘤中的p53基因的突變、肺癌的ras基因突變等。總之，SSCP分析法是一種快速、簡便、靈敏的突變檢測方法，適合臨床實驗室的要求.它可以檢測各種點突變，短核苷酸序列的缺失或插入.隨著SSCP分析不斷完善，它將成為基因診斷研究的一個有力工具.PCR-SSCP技術原位雜交原理與方法原位雜交組化（簡稱原位雜交，insituhybridizationhistochemistry；ISHH）屬於分子雜交的一種，是一種應用標記探針與組織細胞中的待測核酸雜交，再應用標記物相關的檢測系統，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術。當然雜交分子的形成並不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。探針的種類1、同位素標記探針：同位素標記物有3H、35S、125I和32P。2、非同位素標記探針：生物素、地高辛和螢光素三種。

按核酸性質DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。

原位雜交分為菌落原位雜交和組織原位雜交。菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）菌落原位雜交是將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然後將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘乾固定於膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，並與平板上的菌落對位。組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然後進行雜交。而原位雜交是經適當處理後，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。螢光原位雜交技術（FISH)檢測細胞染色體畸變螢光原位雜交技術使在原位雜