分子生物学技术课件.pptVIP

基因表達據受體細胞的不同可分為：1．原核表達系統：將外源基因引入原核細胞，並使其在原核細胞中以發酵形式快速高效地表達、合成基因產物的體系。2．真核表達系統使外源基因在真核細胞中表達的體系。外源基因在原核表達系統中表達的必要條件：刪除內含子和5’非編碼區外源基因置於強啟動子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩定且可有效轉譯，形成的蛋白質不被降解影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素：1、啟動子：建立表達載體時，選擇強啟動子。常見原核強啟動子：Plac：受Lac阻遏蛋白負調，受IPTG的誘導Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動子和Trp啟動子的雜合啟動子。PL和PR啟動子：噬菌體早期左/右向啟動子，受λ噬菌體CI基因負調控。溫度誘導。2、基因劑量：3、核糖體結合位點：SD順序與16srRNA3’末端互補程度。AUG—SD間距離。AUG後的核苷酸。五．原核表達載體：?適用於在原核細胞中表達外源基因的載體。主要元件：強啟動子SD順序篩選標誌其他調控基因1.表達載體類型：融合型表達載體：----融合蛋白非融合型表達載體：---天然完整蛋白分泌型表達載體：----產物可跨膜分泌至胞周間隙（一）融合型表達載體PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因技術關鍵：克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點加人工合成的DNA接頭構建位相載體分子生物學技術基因的克隆與表達基因克隆基因表達概述克隆載體受體細胞基因克隆工作流程體外重組的策略基因克隆（分子克隆molecularcloning）----通過體外重組技術,將一段目的DNA經切割、連接插入適當載體，並導入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。重組子（雜合DNA）基因克隆的技術路線目的基因載體受體細胞（轉化）篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代DNADNA分子的酶切與連接需要限制性內切酶和連接酶來執行限制性內切酶

限制性內切酶由細菌合成，有三大類，其中只有限制性內切酶Ⅱ為基因克隆中要用到的；限制性內切酶能專一地識別DNA分子上特定的堿基序列並在該序列處將DNA切斷；限制酶產生的切口（nick）類型：

(1)形成黏末端(2)形成平末端限制性內切酶識別序列的特點專一性常由4-6個堿基組成具有回文序列酶來源識別序列切割末端EcoRⅠ大腸桿菌5’GAATTC3’3’CTTAAG5’黏末端BamHⅠ澱粉芽孢桿菌GGATCCCCTAGG黏末端PvuⅡ普通變形菌CAGCTGGTCGAC平末端HindⅢ流感嗜血桿菌RdAAGCTGTTCGAC黏末端AluⅠ滕黃節桿菌AGCTTCGA平末端NotⅠ豚鼠耳炎諾卡氏菌GCGGCCGCCGCCGGCG黏末端限制性酶切的條件限制性內切酶發揮最大活性的最適條件：PH值：7.4反應溫度：37℃適當的離子強度(由NaCl提供)和鎂離子(Mg2+)濃度加還原劑(DTT)限制性內切酶的滅活70℃保存20分鐘，滅活限制性酶苯酚抽提，除去限制性酶加入EDTA鼇和鎂離子，阻止限制性酶的作用連接酶將載體分子和將要被克隆的DNA連接到一起需要DNA連接酶來催化DNA連接酶在兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，修復雙螺旋分子上一條鏈上的斷裂，也可以將兩個單獨的DNA分子或同一分子的兩個末端連接在一起基因工程中使用的連接酶主要是從感染T4噬菌體的大腸桿菌E．coli中分離得到的T4-DNA連接酶克隆載體(質粒，plasmid）複製基因(replicator)選擇性記號克隆位點受體細胞定外源DNA導入的細胞，是重組體擴增的場所。易於接納外源DNA無特異的內源性核酸內切載體複製、擴增不受阻克隆位點定義：是一類小型閉合環狀核外雙螺旋DNA分子，能獨立於細胞核進行自主複製。大小：約為2~100×106Dalton，上面攜帶有數個到數十個甚至上百個基因。性質：①可以在細胞質中獨立於染色體之外獨立存在（游離態），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；②質粒是一種複製子（replicon），根據自我複製