第四章目的基因的制备.pptVIP

b)接头-衔接头法第63页，共94页，星期日，2025年，2月5日c)mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反转录合成cDNA第一链后，将dA残基加到mRNA：cDNA杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以DNA.缺点：克隆的效率低（为双链cDNA克隆的1/10）第64页，共94页，星期日，2025年，2月5日6)cDNA文库的筛选和鉴定核酸杂交:是最常用、最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子*同源探针：至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.*部分同源探针：探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.第65页，共94页，星期日，2025年，2月5日b)特异性免疫学检测:在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测.c)cDNA克隆的同胞检测:将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的cDNA文库，对每组cDNA文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆．第66页，共94页，星期日，2025年，2月5日第三节目的基因的分离1.目的基因的功能克隆1)根据蛋白质氨基酸序列分离目的基因对于未知功能的蛋白质基因，其目的基因的分离可从蛋白质开始，通过蛋白质的分离纯化、蛋白质氨基酸序列的测定、相对应的基因片断序列的设计，制备PCR扩增引物或合成DNA探针，从总DNA中分离目的基因片断。或根据特异性蛋白质制备特异性抗体，然后从表达文库中筛选克隆子第67页，共94页，星期日，2025年，2月5日文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。第31页，共94页，星期日，2025年，2月5日保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大第32页，共94页，星期日，2025年，2月5日b）基因文库的筛选表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选．抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长．分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选．免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选．PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段．第33页，共94页，星期日，2025年，2月5日3.真核生物基因组文库的构建1)真核生物基因组DNA的制备YAC载体系统：制备的基因组片段10Mbp*染色体分带技术将各个染色体分离?载体系统：制备的基因组片段200kbp*采用常规的基因组DNA的制备方法第34页，共94页，星期日，2025年，2月5日2)真核基因组DNA一级文库的构建（YAC文库）a)染色体DNA的部分酶切获得平均长度为200-500kb的DNA片段*多切点限制性内切酶：EcoRI，BamHI特点：有较多重叠克隆子*稀切点限制性内切酶：NotI，MluI特点：重叠克隆子较少第35页，共94页，星期日，2025年，2月5日b)酶切片段与YAC克隆载体连接YAC克隆载体pYAC4第36页，共94页，星期日，2025年，2月5日C)酶切片段与载体连接*第37页，共94页，星期日，2025年，2月5日d)重组YAC载体转化酵母球形体1?g基因组DNA500个转化体e)YAC文库的筛选1）探针杂交法：以特异性的探针分子与文库的克隆子进行杂交2）PCR筛选法：第38页，共94页，星期日，2025年，2月5日f)YAC基因组文库的保存活化菌体：将含重组载体的阳性克隆（AB1380菌株）划线接种于AHC平板上，于30oC培养至长出1-3mm的红色菌落。短期保存：parafilm膜将平板周围封起来于4oC保存4-6周。长期保存：接种一个单独的YAC克隆子于3m