细胞生物学课件第三章细胞技术.pptVIP

六、PCR技术PCR即：polymerasechainreaction。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），约15-20个核苷酸；③4种dNTP；④TagDNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermusaquaticus，最适作用温度75~80℃，短时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+。反应过程：①变性：约90-95℃；②复性：约60℃左右；③延伸：70-75℃；④重复“变性——复性——延伸”过程20-30次循环。第62页，共90页，星期日，2025年，2月5日PCR原理第63页，共90页，星期日，2025年，2月5日（十）当代显微镜的发展趋势组合模式：集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。第30页，共90页，星期日，2025年，2月5日明暗偏第31页，共90页，星期日，2025年，2月5日二、电子显微镜（一）透射电子显微镜transmissionelectronmicroscope,TEM第32页，共90页，星期日，2025年，2月5日以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopicstructures）。1.原理第33页，共90页，星期日，2025年，2月5日第34页，共90页，星期日，2025年，2月5日透射电子显微镜TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM第35页，共90页，星期日，2025年，2月5日表二、不同光线的波长第36页，共90页，星期日，2025年，2月5日2、制样技术1）超薄切片电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。第37页，共90页，星期日，2025年，2月5日第38页，共90页，星期日，2025年，2月5日2）负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。NegativeStainedActin肌动蛋白纤维的负染电镜照片第39页，共90页，星期日，2025年，2月5日3）冰冻蚀刻freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，即为复膜（replica）。AYeastCell第40页，共90页，星期日，2025年，2月5日20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。（二）扫描电子显微镜第41页，共90页，星期日，2025年，2月5日Scanningelectronmicroscope（SEM）第42页，共90页，星期日，2025年，2月5日工作原理：用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。第43页，共90页，星期日，2025年，2月5日扫描电子显微镜原理第44页，共90页，星期日，2025年，2月5日第45页，共90页，星期日，2025年，2月5日酵母细胞第46页，共90页，星期日，2025年，2月5日（三）扫描隧道显微镜

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液