真核基因组提取.pptVIP

注意事项材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。由于真核生物基因组较大，操作时应注意轻柔，最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。第28页，共53页，星期日，2025年，2月5日实验结果核酸（DNA及RNA）的鉴定及定量紫外分光光度法琼脂糖凝胶电泳法第29页，共53页，星期日，2025年，2月5日紫外分光光度法

—测定DNA的纯度和浓度原理：DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫外光区具有较强的吸收,其吸收峰在260nm处。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染时，会影响DNA吸收光的准确测定。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230计算其比值来衡量样品的纯度。第30页，共53页，星期日，2025年，2月5日即OD260＝1时：dsDNA(双链DNA)浓度约为50μg/mLssDNA(单链DNA)浓度约为37μg/mlRNA浓度约为40μg/ml寡核苷酸浓度约为30μg/ml浓度的计算dsDNA浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×50/1000RNA浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×40/1000第31页，共53页，星期日，2025年，2月5日纯度的检测DNA纯品的OD260/OD280约为1.8。OD260/OD280＞1.9说明含有RNA污染；OD260/OD280＜1.6说明有残余的蛋白质、酚等存在。OD230/OD260的比值应在0.4~0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。有些分光光度计则显示OD260/OD230，其比值应在2~2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。第32页，共53页，星期日，2025年，2月5日琼脂糖凝胶电泳法

—分离鉴定核酸的常规方法用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖（Agarose，AG）是琼脂中不带电荷的中性组成成份（几乎不含硫酸根，主要成分为多糖），其水溶液可以制成凝胶，具有多孔网状结构。第33页，共53页，星期日，2025年，2月5日结果观察：制备凝胶时先加入少量荧光染料，其分子可插入DNA的碱基之间，可在紫外灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置（荧光条带），也可在经凝胶成像系统中直接拍照。第34页，共53页，星期日，2025年，2月5日琼脂糖凝胶制备及电泳凝胶制备倒胶点样电泳紫外灯下观察第35页，共53页，星期日，2025年，2月5日1、凝胶准备（0.8%）:用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。①称0.8g琼脂糖置三角瓶中，加100mL1×TAE②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃，加入荧光染料2μL，并轻轻混匀。2、倒胶：①将冷却60℃的凝胶缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。②室温下静置20min，凝胶凝固。③拨出梳子，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。第36页，共53页，星期日，2025年，2月5日3、点样：①向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，让液面高于胶面1mm。②样品准备：吸取5μL已提取的基因组DNA点在点样纸上，加入1μL6×上样缓冲液，用移液器轻轻混匀。③上样：用移液器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。上样缓冲液（loadingbuffer）作用：指示剂；沉降作用（含甘油），防止漂样。第37页，共53页，星期日，2025年，2月5日4、电泳：①盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。电泳条件：电压80v（恒压）；时间30min左右（根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳）②电泳结束后，切断电源，取出凝胶。5、紫外灯下观察并分析结果：①紫外检测仪直接观察电源条带②摄影记录第38页，共53页，星期日，2025年，2月5日真核基因组提取*第1页，共53页，星期日，2025年，2月5日实验目的熟悉真核DNA提取的方法和原理掌握真核生物基因组的结构及特点*第2页，共53页，星期日，2025年，2月5日分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂