载体连接酶切基因现在学转化14课件.pptx

连接载体酶切基因重组DNA分子现在学转化

目的基因的获得基因工程课件上海农林职业技术学院

目的基因：是指已经或准备要分离、改造、扩增或表达的基因或DNA片段。获得目的基因的前提：了解基因，然后才能制定获取的方案。上海农林职业技术学院基因工程课件

一、基因/基因组文库的构建既从基因组中直接分离目的基因的方法构建过程如下：提取基因组DNA切割成大小合适的DNA片段DNA片段与载体连接成重组DNA分子重组DNA分子转入受体细胞（包装）受体细胞扩增、繁殖筛选、鉴定带有目的基因的克隆上海农林职业技术学院基因工程课件

理论上，这些重组子包含整个基因组DNA序列，既某种生物的全部基因，因此称之为基因组文库或基因文库上海农林职业技术学院基因工程课件

基因文库构建基本步骤基因工程课件上海农林职业技术学院俗称鸟枪法

染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接若转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；若转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。基因工程课件上海农林职业技术学院

如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞转化受体细胞基因工程课件上海农林职业技术学院

局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构基因工程课件上海农林职业技术学院

简述基因文库的构建过程。请指出基因文库法获得目的基因的缺陷。

二、cDNA文库构建基因工程课件上海农林职业技术学院首先提取总RNA注意事项：组织选择避免RNA酶分布非常广泛DEPCRNA酶抑制剂

cDNA法克隆目的基因的基本战略mRNAcDNA第一链的合成以mRNA为模板,经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补。5’AAAAAAAAAAAAAA3’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’5’AAAAAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTTTT5’cDNA第一链引物退火逆转录酶4种dNTP基因工程课件上海农林职业技术学院3’

cDNA第二链的合成DNA聚合酶S1基因工程课件3’AAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTTTTmRNAcDNA第一链碱变性RNAaseH5’TTTTTTTTTTTTTcDNA第一链3’自发形成颈环结构5’TTTTTTTTTTTTTcDNA第一链3’AAAAAAAAAAAAcDNA第二链5’TTTTTTTTTTTTTcDNA第一链3’AAAAAAAAAAAAcDNA第二链S1切掉颈环结构上海农林职业技术学院

cDNA文库法获得目的基因的基本过程完备分离程序提取mRNA=〉合成总cDNA=〉全部克隆=〉筛选目的重组子适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等基因工程课件上海农林职业技术学院

cDNA文库法获得目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因基因工程课件上海农林职业技术学院

请大家说一下基因文库和cDNA文库的区别

全基因合成前提：基因序列已知1、小片段连接法：分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段，再连接起来。混合退火T4-DNA连接酶连接基因工程课件上海农林职业技术学院三、化学合成法获得目的基因

全基因合成2、补钉延长法退火分别合成12-15碱基的短单链DNA20-30碱基的长单链DNAT4-DNA连接酶连接Klenow酶聚合基因工程课件混合化学合成法获得目的基因上海农林职业技术学院

全基因合成3、大片段酶促法混合退火合成40-50碱基的片段T4-DNA连接酶连接Klenow酶聚合基因工程课件化学合成法获得目的基因上海农林职业技术学院

探针合成探针通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域基因工程课件化学合成法获得目的基因引物合成

化学合成的单元操作化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应。基因工程课件上海农林职业技术学院

目的基因获得的几个作业

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