疾病产生的分子基础.pptVIP

二、基因结构和表达与疾病的研究策略1．通过结构分析确定基因变异PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接测序法、TaqMan探针法SNP分型、SNaPshot分型法、MassArray分型法2．基因表达水平分析差异显示、基因表达芯片、RNA-seq分析3．通过功能学研究确定致病基因转基因技术、基因敲除、RNAi技术、基因诱导超表达第27页，共63页，星期日，2025年，2月5日1．通过结构分析确定基因变异PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接测序法、TaqMan探针法SNP分型、SNaPshot法、MassArray法*第28页，共63页，星期日，2025年，2月5日（1）单链构象多态性

(PCR-SSCP)PCR产物变性后，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。*第29页，共63页，星期日，2025年，2月5日PCR产物用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在琼脂糖凝胶电泳上分辨。不同等位基因经切割后产生不同长度的DNA片段条带。（2）限制性片段长度多态性

(PCR-RFLP)*第30页，共63页，星期日，2025年，2月5日RFLPRestrictionFragmentLengthPolyhmorphism第31页，共63页，星期日，2025年，2月5日（3）直接测序法Sanger法双脱氧核苷酸，ddNTP及荧光标记的四个碱基，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，获得DNA碱基序列。*第32页，共63页，星期日，2025年，2月5日*第33页，共63页，星期日，2025年，2月5日（4）TaqMan探针法SNP分型针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。存在PCR产物时，产生适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。*第34页，共63页，星期日，2025年，2月5日（5）SNaPshot法测序酶、四种荧光标记ddNTP、5’-端不同长度延伸引物和PCR产物模板，引物延伸一个碱基即终止，经检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。通常用于10-30个SNP位点分析*第35页，共63页，星期日，2025年，2月5日(6)MassArray法MassEXTEND单碱基延伸反应，紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。*第36页，共63页，星期日，2025年，2月5日2．基因表达水平分析

差异显示、基因表达芯片、RNA-seq分析*第37页，共63页，星期日，2025年，2月5日（1）差异显示技术(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differentialexpression）。第38页，共63页，星期日，2025年，2月5日原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，polyA尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：根据这12种排列组合，设计12种不同的引物。这些引物由11~12个T及两个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。第39页，共63页，星期日，2025年，2月5日5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用3’锚定引物和5’随机引物进行扩增，可获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能