蛋白层析仪器系统.pptxVIP

蛋白层析系统

李秀男Email:中国科学院过程工程研究所

生化工程国家重点实验室

主要内容1.概述2.蛋白层析系统的组成3.输液系统4.进样系统5.检测系统6.日常维护7.选型购买

液相色谱（层析）的发展01古罗马时期人们用布或纸分析染料与色素；021903年，Tsweet发表首篇有关层析的论文；031960s,HPLC商用仪器出现04高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法051概述

层析分类特性层析分类介质粒度(μm)操作压力(MPa)低压40~200不明显高于1atm中压25~400.5~4高压3~104~20

输液系统：提供连续、稳定而精确的流量；进行梯度洗脱；进样系统：引入样品层析柱检测系统：对分离后各组份进行检测给出响应信号，并进行处理产品收集系统：收集分离产物2.蛋白层析系统的构造

构造简图六通阀流动相输送系统进样系统流动相贮罐计量泵进样环层析柱检测器分部收集器工作站梯度混合检测系统

AKTA组成示意图

堆积型国产GradiFrac(GE)

简单整合型AKTAPrime(GE)BioLogicLP(BioRad)

复杂整合型AKTAExplorer(GE)BioLogicLP(BioRad)

按规模分实验室规模AKTApure流速150mL/min中试规模AKTApilot流速4-400mL/min生产规模AKTAprocess流速0.75-30L/min

流动相输送方式高位槽气体压力出口抽真空泵送系统蠕动泵柱塞往复泵其他类型的泵，如隔膜泵最常用梯度混合方式梯度混合器电磁阀（低压梯度）高压梯度3输液系统

最简单的方式压力真空高位槽蠕动泵

蠕动泵（软管泵）工作原理结构简单，无密封件，无阀门维护方便，易于清洗和清洁可输送含颗粒液体以及高粘流体很好的自吸功能，可干转剪切力小，适合输送对剪切力敏感的物料精度差脉动大压力低优点：缺点：

蠕动泵类型单通道泵多通道泵

柱塞往复泵特点耐高压脉冲小流量宽、无极可调重复性好、准确度高

柱塞泵工作原理单向阀结构球座吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头抛光面宝石球流动相工作原理

柱塞泵分类按柱塞个数单柱塞双柱塞三柱塞按工作方式并联泵串联泵

偏心轮双柱塞并联泵偏心轮通过每圈不同阶段电机转速控制控制要求较高AKTA做到了

凸轮双柱塞并联泵理论速度曲线加工精度为0.01mm时的速度曲线加工精度要求较高

柱塞泵的操作注意事项柱塞杆和密封圈缓冲液泄露会导致盐析出，损伤柱塞杆和密封圈使用20%乙醇作为泵后清洗液保持流动，并定期检查是否流空或者长菌使用完高盐溶液后用纯水冲洗至少半个小时单向阀最怕堵塞流动相用0.45um膜过滤超纯水和色谱纯试剂可以直接使用

隔膜泵生产规模设备常用特点：低剪切、大流量德国QuattroFlow四元隔膜泵AKTAprocess三元隔膜泵

梯度洗脱系统BA磁力搅拌器梯度混合器比例阀脱气机低压梯度BABA高压梯度

梯度混合器BA磁力搅拌器两杯液位始终保持平衡；两杯溶液混合速度以及输出流量均可调节，可以作出各种不同斜率的线性梯度；按不同阶段的时间作适当的输出流量调节，还可以做出各种不同的台阶形梯度。

低压梯度低压梯度比例阀脱气机通过电磁阀的分时切换来实现流动相梯度AB

高压梯度

如何考察梯度混合性能02简单判断梯度比例阀是否泄漏——设定泵使用一个单独通路（如A），泵出口排空，开大流速，观察其他通路（B等）的流动相是否流动，正常时均不应流动。综合考察梯度性能——流动相A：水；流动相B：1%丙酮不接层析柱，280nm检测，编辑梯度，设定流速，不进样进行检测01

AKTA梯度性能考察水0.5-1.0%(v/v)丙酮

层析过程优化采取梯度洗脱或者阶越式洗脱方式；01反相层析探索条件时，梯度应尽可能长（20个柱体积）；02当发现进错样时，不可以为了节约时间，而直接用100%流动相B（有机相）洗脱，否则会不可逆地损坏层析柱。03蛋白质的梯度洗脱注意事项

手动进样直接倒入柱子顶部进样阀进样01自动进样02泵进样03柱切换进样044进样系统

进样阀手动进样阀自动进样阀定子（Stator）转子（Rotor）

AKTA进样阀操作

手动进样注意事项进样动作：Load状态时平缓推针，切换到Inject后再拔针以防倒吸清洗：在Inject状态清洗进样口对于Rheodyne进样器一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.028英寸，长2英寸的平头针。一定不能使用尖针，它会严重刮坏转子垫圈。废液口：出口末端应与进针口水平以防倒吸或虹吸

进样阀操作注意事项进样阀靠转子和定子的面密封，无法保证100%不泄露缓冲液泄露会导致盐析出，损伤密封面和导流槽，严重时造成漏液和两个导流槽之间短路实验完成后用纯水在load和inject状态下清