细胞工程原生质体培养和植物体细胞杂交.pptVIP

*酶解前，叶片和子叶要撕去下表皮，将去表皮的一面向下放入酶液中。若去表皮困难可把叶片切成小块后放入酶液中下胚轴可直接切成小块后放入酶液中；愈伤组织或悬浮细胞可过滤后进行酶解。组织块放入酶液中后可真空抽率5~10min，待组织中无气泡逸出为止，使酶液能充分渗入组织中，提高酶解效率。酶解处理利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间获得大量而有活力的原生质体。其过程一般为将酶解材料放入装有酶液的培养皿中进行酶解，或在静止条件下每隔一段时间轻轻摇动，或将培养皿放在30~50r/min的摇床上轻轻振荡以游离原生质体。应注意以下条件：a植物材料应按比例和酶液混合，才能有效地游离原生质体；b不同材料其生理特性不同，对酶液中渗透压的要求也不同；c酶的种类、浓度和酶解时间因材料而异；d酶液pH值一般在5.4~6.0；e酶解温度控制在24~28℃左右；f黑暗或弱光下进行*酶解前，叶片和子叶要撕去下表皮，将去表皮的一面向下放入酶液中。若去表皮困难可把叶片切成小块后放入酶液中下胚轴可直接切成小块后放入酶液中；愈伤组织或悬浮细胞可过滤后进行酶解。组织块放入酶液中后可真空抽率5~10min，待组织中无气泡逸出为止，使酶液能充分渗入组织中，提高酶解效率。*植物材料经酶解处理后的混合物中除了完整无损伤的原生质体之外，还含有未去壁的细胞、细胞碎片、细胞团等组织残渣，只有将这些杂质和酶液除掉，使原生质体纯化，才能进行培养。一般先将酶解混合物通过一定孔径的筛网(40~100um)过滤，除去未消化的细胞团和组织块等较大的杂质，收集滤液于离心管中。因植物材料和所使用的渗透压稳定剂不同，进一步的纯化方法如下：*在酶解处理中用相对分子质量较小的甘露醇作为渗透压调节剂时*在酶解处理中用相对分子质量较大的蔗糖作为渗透压调节剂时*界面法——梯度离心法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片等杂质则沉于管底，用这种方法可获得更为纯净的原生质体。如由顶部6%聚蔗糖（Ficoll）和底部9%聚蔗糖（溶于含有7%山梨醇的MS培养基中）组成的剃度经150g离心5min,细胞碎片将沉于管底,而原生质体则漂浮于上部**荧光素双醋酸酯荧光原理：当光线以一个特定的波长射出（激发态），某些化学物质会再反射出一种波长更长的荧光（发射态）。

只有少数几种化学物质具有荧光特性，并提供高度选择性的测量。

激发光打在被测物质上，被测物质中的分子、原子吸收激发光的能量后，从低能级跃迁到高能级。该高能级是不稳定的，经过一段时间后，分子、原子自发的从非稳态的高能级跃迁到稳态或亚稳态的较低能级，同时发出一个光子。不同的原子、分子的能级是固定的，因此它们发出的光子能量是一定的，即波长一定。我们只要测出该荧光的波长，即可以识别所测物质的元素和成份，而比较荧光强度，我们可以测出它的含量。太阳光谱中以红光波长最大，向紫光方向波长逐渐短，在短波波段中蓝光能量最大，散射出来的光波也最多，因此我们看到的天空呈现蔚蓝色。原生质体活力的测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。?如形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。*（一）培养基原生质体培养基在很大程度上影响原生质体再生和其后的分化以及器官形成不同材料使用的培养基不尽相同，一般说来能用于植物细胞和组织培养的培养基只需一定的变化即可用于原生质体培养。一般需考虑以下因素:无机盐、碳源和渗透压稳定剂、有机附加物和激素、培养基的pH值*原生质体的初始植板密度对其培养效率有显著的影响，在适宜的密度范围内原生质体易于分裂增殖。密度过高，往往会由于养分不足或细胞代谢物过多而妨碍再生细胞的正常生长。密度过低，原生质体的再生细胞一般不能持续分裂。因此，原生质体培养的密度一般是1x104/ml~1x105/ml。*植板可采用液体法或半固体法。*植板可采用液体法或半固体法。*原生质体的培养条件主要是指培养的光照和温度条件。原生质体培养对培养条件的要求十分严格，且不同来源的原生质体在不同的培养阶段有不同要求。一般来说：----新分离出来的原生质体应在散射光或黑暗中培养，在诱导分化阶段再置于光下培养；----不同植物原生质体培养对温度的要求不尽相同，一般为25～30℃*⑴原生质体培养可实现细胞融合，克服传统育种中杂交不亲和现象，并克服雄配子体细胞质基因不能遗传给下一代的现象；⑵利用其进行研究植物细胞壁的形成；⑶利用其实现细胞对外源基因、DNA片段、细胞器、染色体的捕获，原生质体为植物细胞工程研究提供了一个方便的遗