酶的固定化技术兰欣49课件.pptx

;固定化生物技术

通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。;工作任务（二）;固定化技术;固定化技术;包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。;固定化技术;固定化技术;（2）海藻酸钙凝胶包埋法

称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶液或细胞混合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中。

优点：操作简便、条件温和，对细胞无毒害，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径。

使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，维持一定的钙离子浓度。;固定化技术;（3）角叉菜胶包埋法

角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属，自然分布于大西洋沿岸和我国东南沿海以及青岛、大连等海域，是中国的一种重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶生产的重要原藻，而且近年来越来越多地应用于医药领域，引起人们的广泛关注。;固定化技术;（4）明胶包埋法

将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。灭菌后冷却到35°C以上，与一定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能试剂交联。

（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法

先配置一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺与一定量的酶液等混合均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合即可获得。

优点：机械强度高，可调节凝胶孔径

缺点：丙烯酰胺单体有毒性

;固定化技术;（6）光交联树脂包埋法

例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得

优点：强度高、使用时间长固定化时间短;（7）半透膜（微囊型）包埋法

是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。半透膜的孔径只有几?至几十?，所以也称为微囊化法。适用于底物和产物都是小分子物质的固定化;结合法

选择适宜的载体，???之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。;根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：

离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。

共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。

酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，;交联法

借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。

常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。

戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。;交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。

热处理法

将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制备得到的固定化菌体。

只适用于热稳定性较好的酶的固定化，严格控制加热温度和时间。

热处理法也可以与交联法或其他固定化方法联合使用。

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