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响应面法优化木豆叶总黄酮酶提取工艺 木豆是科可可豆科生物。它分布在东南亚、印度、中国西南部和海南其他省份。木豆叶药用价值很高,可用于治疗外伤、烧伤、褥疮[2~3]、肝炎、结石、黄疸、小儿水痘和糖尿病等症[4~5]。木豆叶的主要活性成分为黄酮类和芪类化合物,其中黄酮类化合物主要包括牡荆苷、异牡荆苷、球松素、芹菜素等。研究证实木豆叶黄酮类成分具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、镇定、解痉、治疗股骨头坏死等多种药理活性[7~11]。 目前木豆中总黄酮的提取主要有冷浸提取、超声提取、热回流提取、微波提取等传统方法。酶法提取天然产物中的活性成分较其他方法具有耗能低、反应条件温和、提取时间短等优点,近年来酶法提取作为一种新兴技术广泛用于植物有效成分的提取分离。但迄今为止尚未见酶法提取木豆叶总黄酮的研究报道,本研究中笔者拟采用纤维素酶辅助提取木豆叶总黄酮,以期为木豆叶总黄酮的开发利用提供实验依据。 1 仪器和试剂盒 1.1 紫外分光光度计 WK891烘干箱,河北黄骅生产;AB104型电子天平,瑞士生产;紫外分光光度计,瑞典Pharmacia Biotech公司生产;KQ-250DB型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司生产;水浴锅。 1.2 药物检定所需的药品及制剂 木豆叶药材由浙江海正药业股份有限公司提供;芦丁标准品(质量分数≥97%,批号1000802-200829)购于中国药品生物制品检定所;纤维素酶(400 U·mg-1)购于上海维编有限公司;95%乙醇;硝酸铝;氢氧化钠;亚硝酸钠;无水甲醇等均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 不同浓度alno33溶液 参照吕欣等测定总黄酮的方法,精确称取恒重干燥的芦丁对照品5 mg,用无水乙醇溶解,摇匀,定容至5 mL,配成浓度为1 mg·mL-1的芦丁标准品贮备液。精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL贮备液,分别加水至3 mL,加5%Na NO2水溶液0.5 mL,静置6 min,10%Al(NO3)3溶液0.5mL,放置6 min,加5%NaOH溶液2.5 mL,混匀静置15 min,以蒸馏水定容至10 mL。测定500 nm处吸光度,以吸收度Y为纵坐标,浓度X为横坐标,进行线性回归,得到回归方程Y=0.0103X+0.0446,相关系数R2=0.9997。 2.2 纤维素酶活性提取 准确称取木豆叶干粉1.0 g置于容积100 mL三角瓶,加入20倍量的纤维素酶水溶液,在设定温度下水浴提取一定时间后再加入乙醇,调节乙醇浓度为80%,醇提1 h,过滤,滤渣以同样条件再提取2次,过滤、合并滤液,然后定容至100 mL容量瓶中。用“2.1”项下方法测定提取液中总黄酮含量: 2.3 单因素试验和响应面法试验 根据Box-Behnken中心组合设计原理,结合单因素实验结果,选择酶用量、酶解温度、酶解时间和酶解p H值4个因素,在单因素试验基础上采用4因素3水平响应面分析方法确定总黄酮的最佳提取条件。试验因素与水平设计见表1。 3 结果与分析 3.1 酶解时间和ph值对总黄酮得率的影响 加酶量在0.25~16 mg时对总黄酮得率的影响趋势为,随着酶量增加,总黄酮得率增大,当加酶量达8 mg时总黄酮得率达到最高,酶量大于8 mg时,随酶量增加总黄酮得率反而减弱,可能是过量的纤维素酶与木豆叶组织结构中纤维素底物之间的吸附作用达到饱和,抑制了活性成分的传质与释放,本实验适宜加酶量范围为6~10 mg。 酶解时间在0.5~4 h时对总黄酮得率的影响趋势为,酶解时间在0.5~2.0 h时,随酶解时间延长总黄酮得率逐渐增大,酶解时间达到2.0 h时,总黄酮得率最高,而酶解时间在2.0~4.0 h时,随酶解时间的延长,总黄酮得率则呈降低趋势,其适宜酶解时间为1.5~2.5 h。 酶解pH值在3.5~6范围内对总黄酮得率的影响如下,pH值由3.5增加到4.5时,总黄酮得率变化不明显,而pH值在4.5~5.0时,总黄酮得率增加较快,pH值达到5.0时总黄酮得率最高,pH值超过5.0后,总黄酮得率逐渐下降,其适宜pH范围为4.5~5.5。 酶解温度在25~50℃对总黄酮得率影响的影响如下,随着酶解温度的升高,总黄酮得率也逐渐增大,当温度达到35℃时总黄酮得率最高,而后逐渐下降,其适宜温度范围为30~40℃。 3.2 回归方程拟合及方差分析结果 根据单因素试验结果,采用Box-Behnken设计,以酶用量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)和酶解p H(D)为自变量,总黄酮得率(Y)为响应值,进行响应面分析,试验结果见表2,方差分析及回归系数显著性检验结果见表3。 采用Design-expert8.0软件对表2中数据进行多项式拟合回归,建立多元二次响应面回归模型: Y=-51.940 46+