SN_T 3630-2013果蔬中溶组织内阿米巴包囊检测方法 巢式PCR-RFLP法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3630—2013果蔬中溶组织内阿米巴包囊检测方法巢式PCR-RFLP法Detection of Entamoeba histolytica cysts in vegetables andfruits-Nested PCR-RFLP method2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国O发布国家质量监督检验检疫总局奇南件 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准果蔬中溶组织内阿米巴包囊检测方法巢式PCR-RFLP法SN/T3630—2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址中国标准出版社秦皇岛印剧厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数18千字2014年2月第一版2014年2月第一次印刷印数1-1600*书号：155066·2-26516 SN/T 3630-2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、天津生物芯片技术有限责任公司。本标准主要起草人：王乃福、昊冬雪、张海英、高旗利、曹勃阳。1 SN/T3630—2013果蔬中溶组织内阿米巴包囊检测方法巢式 PCR-RFLP法1范围本标准规定了果蔬中溶组织内阿米巴包囊的巢式PCR-RFLP检测方法。本标准适用于果蔬中溶组织内阿米巴包囊的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析试验室用水规格和实验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义、缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1.1溶组织内阿米巴EntamoebahistolyticaSchaudinn溶组织内阿米巴即痫疾阿米巴，属内阿米色科的内阿米巴属，为侵袭型阿米巴病的病原虫，主要寄生于结肠，引起侵袭性肠道和肠道外阿米巴病，为全球分布，多见于热带与亚热带；溶组织内阿米巴主要感染人类和其他灵长类动物；生活史可分为滋养体、囊前期、包囊和囊后滋养体4期，成熟的4核包囊为感染期，在传播上起重要作用仅见于宿主的粪便内。3.1.2溶组织内阿米巴包囊Entamoebahistolyticacyst滋养体在肠腔里形成包囊的过程称为成囊（encystation）。滋养体在肠腔以外的脏器或外界不能成囊。在肠腔内滋养体逐渐缩小，停止活动变成近似球形的包囊前期（precyst），以后变成一核包囊并进行二分裂增殖。胞质内有一特殊的营养储存结构即拟染色体（chromatoid body），呈短棒状，对虫株鉴别有意义。在未成熟包囊中有糖原泡（glycogenvacuole）。成熟包囊有4个核，圆形，直径为10um～20μm不等，包囊壁厚约125nm～150nm;核为泡状核，与滋养体的相似但稍小。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。nestedPCR：巢式聚合酶链反应RFLP：限制性片段长度多态性4设备和材料4.1高速冷冻离心机：最大离心力13000g。 SN/T3630-—20134.22离心机：最大离心力5000g。4.3样品处理器具：刀、镊子、剪刀。4.4均质袋（400mL）。4.5显微镜；10×～100×。4.6铜网：40目。4.7PCR扩增仪。4.8电泳仪。4.9凝胶成像系统。4.10可调移液器：0.1μL~2μL，1μl~10μ，20μl100μl，100μ~1000μl。4.11电子天平：感量0.001g。4.12水浴锅。5主要试剂除另有规定外，试剂为分析纯，实验用水均为灭菌双蒸水，规格符合GB/T6682一级水的要求。5.10.5%SDS溶液。5.2Lugol碘液原液：碘化钾10g，碘5g，蒸馏水100ml。先用20mL~50mL水溶解碘化钾，再加人碘，待溶解后，加水至100mL，再加入少许碘，不被溶解，有助于溶液长期稳定（阴暗处棕色瓶保存6个月）。工作液：5倍稀释原液，盛于棕色瓶中，每1～2周更换一次。5.3TaqDNA聚合酶。5.4dNTP:dATP,dTTP、dCTP、dGTP。5.5琼脂糖。5.6溴化乙锭。5.7分子量标记：150bpDNAMarker。5.8DNA提取试剂盒5.9DraI和Sau96I限制性内切酶。5.10TE缓冲液:10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)。5.1110XPCR缓冲液:200mmol/LTris-HCl(pH8.4)、200mmol/LKCl、15mmol/LMgCl2