SN_T 4413-2015转基因玉米品系检测 可视芯片检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4413—2015转基因玉米品系检测可视芯片检测方法Event-specific detection for genetically modified corn-Optical biosensor chip method2015-12-04发布2016-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4413—2015言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局，北京大学。本标准主要起草人：章桂明、向才玉、凌杏园、潘广、陈浩东、邓兴旺。I SN/T 4413-2015转基因玉米品系检测可视芯片检测方法1 范围本标准规定了玉米中转基因品系的可视芯片检测方法，包括检测用引物、反应体系、反应条件及结果判定标准。本标准适用于转基因玉米Bt176、59122、NK603、3272、GA21、MON810、MON88017、MON89034、MIR604、MON863、MON87460、T25的品系检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测.抽样和制样方法3原理可视芯片技术是通过多重PCR扩增，获得生物素化PCR产物与芯片上的探针杂交，经由链霉亲和素-碱性磷酸酶介导的显色反应在芯片表面形成色点沉积，检测结果裸眼可视。4设备用具及试剂4.1主要设备及用具4.1.1主要设备组织粉碎机、PCR仪、水浴锅、电子天平（精度：1/1000以上）、低温冷冻高速离心机、低温冰箱、制冰机、恒温干燥箱、pH计、移液器（0.1μL，0.5uL，2uL，10μ，20μL，100μ，200μL，1000μL）、紫外可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、杂合反应仪（或使用可放置96孔板的恒温混匀器也可）、芯片点样仪、紫外交联仪。4.1.2主要用具PCR管(0.2mL)、离心管(1.5mL,2.0.mL)、Tip头(0.1μL~10 μL,5μL～200μL,100μL～500μL)、生物芯片。4.2主要试剂4.2.1常用试剂CTAB、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、70%酒精、RNA酶（10 mg/mL）、Taq DNA聚合酶。1 SN/T 4413—20154.2.2杂合检测试剂探针缓冲液175.3gNaCl,88.2g柠檬酸钠，溶于1000mL焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，HCl调节pH至7.0，高压灭菌。漂洗缓冲液800mL超纯水中溶解0.27gKHzPO4，1.42gNazHPO4，8gNaCl,0.2gKCl然后调pH至7.4，最后定容到1L，高温高压灭菌后室温保存。使用时按体积比加人0.05%Tween-20。杂交反应液1000mL蒸馏水溶液中包括250mL探针缓冲液,9.89%葡聚糖硫酸钠，1%BSA，0.1%SDS。洗涤液1000mL蒸馏水溶液中包括100mL探针缓冲液，0.1%SDS。检测液漂洗缓冲液加1%BSA，0.1%标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素溶液。显色液0.1mol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl1mmol/LMgCl2，调节pH至9.5。使用时新鲜配制，取5 mL 加人 33 μL NBT,16.5μLBCIP。4.2.3探针引物PCR对照探针与检测目标无关的核酸杂交片段。其杂交目标是一段人工设计合成的核酸片段或者是一段特定的已知的目标核酸片段，在PCR反应时被掺入反应体系，参与整个检测流程杂交阳性对照探针为一段5端生物素修饰核酸片段，参与杂交后的显色反应过程。用于可视芯片方法检测的引物和探针用于可视芯片方法检测的引物和探针见表1。所有下游引物5端用生物素修饰，探针5端加不同长度PolyT。表1用于可视芯片方法检测的引物和探针反应体系终扩增产物片段检测基因核苷酸序列引物探针浓度/nmol/L长度/bp或品系(5-3)40FGACCCATATTCCAGGGCACTT18840RzeinTGTTAGGCGTCATCATCTGTGG250P8T-CACCACAGCCACCACTTCTCCTTGGAC2 SN/T 4413—2015表1 (续)检测基因核苷酸序列反应体系终扩增产物片段引物探针或品系(5-3)长度/bp浓度/nmol/LFTCAAGCACGGGAACTGGC320RBt176TGGGCGTGGTATCGACTTTATA320216P25012T-ACGCCATCAATGGCCTTGAAGCCF320GCCTCTTGCTC