NY 558-2002牛海绵状脑病诊断技术.pdf

ICS .11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 558—2002牛海绵状脑病诊断技术Diagnostic techniques for bovine spongiform encephalopathy2002-12-01实施2002-08-27 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 558—2002前言牛海绵状脑病是动物传染性海绵状脑病的一种，对动物和人有着持久性危害并最终致死，世界动物卫生组织[World Organization for Animai Health(英),Office Intentional des Epizootic(法),OIE]将之列为 B类动物疫病,我国将其定为一类动物疫病。本标准是依照OIE 的《诊断试验和疫苗标准手册》（2000 年版）(Manual of standards for Diag-nositic Tests and Vaccines,2000)第 2.3.13 章关于牛海绵状脑病的诊断技术规定制定的。本标准与该文件的差异是：本标准中除症状描述(临床诊断)外，采用该文件规定的两项主要技术即组织病理学诊断和免疫组织化学诊断技术，其他推荐技术未采用；由于《诊断试验和疫苗标准手册》对上述两项技术的具体操作程序未作规定，本标准采用了OIE 传染性海绵状脑病瑞士参考实验室(OIE TSE Reference Laboratory,Institute of AnimalNeurology,University of Bern,Switzerland)的操作程序。本标准的附录 A、附录B、附录 C为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标主要起草人：王志亮、刘雨田、邹艳丽、王树双。- NY/T 558—2002牛海绵状脑病诊断技术1 范围本标准规定了诊断牛海绵状脑病(BSE)的技术要求。本标准适用于牛海绵状脑病的诊断;也可用于其他动物的传染性海绵状脑病(TSE)的诊断。2 临床诊断BSE病牛临床症状各种各样，病程多为数月至一年,最终死亡。当病牛出现以下全部或部分症状而又不能确定为其他疾病时,应怀疑 BSE 的可能。a）行为异常：表现为不安、恐惧、异常震惊或沉郁；不自主运动，如磨牙、震颤；不愿接触水泥地面或进人畜栏等。b）感觉或反应过敏：表现为触、视、听三觉过敏。对颈部触摸、光线的明暗变化以及外部声响过度敏感，这是BSE病牛重要的临床表现。c）i运动异常：病牛步态呈“鹅步”状，共济失调，四肢伸展过度，有时倒地，难以站立。d)体重和体况下降。其他动物的TSE临床症状不尽相同，但确诊须依靠实验室诊断。3 实验室诊断发现可疑病例后，应进行采样，送专门实验室检测，3.1采样将牛头固定，用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开，使脑部暴露。用剪刀剪开脑膜并切断所有与脑部相连的神经和血管，取出整脑。大规模监测时，可用专用工具从枕骨大孔处，取出延脑部分即可。3.2 固定将完整的脑组织浸人10倍体积的固定液(配方见附录A)中固定。一周后更换固定液,再维持一周。3. 3 组织病理学诊断3.3. 1 病料处理3.3.1.1把固定好的脑组织取出,将大脑和小脑去除,横切脑干选取厚度为3 mm～5mm 的脑问部延髓、小脑后脚部延髓和前丘部中脑组织块。3.3.1.2将选取好的组织块放人新配的固定液中再固定一周,其间更换固定液三次，并在水平摇床上不断摇荡，以提高固定液的渗透力。3.3.1.3将固定好的组织块放人流水中漂洗24h。3.3.1.4放人下列不同浓度的酒精中脱水：a）75%酒精中2 h;b）85%酒精中2h;c）95%酒精I中2 h;d)95%酒精直中2 h;e）100%酒精Ｉ中2h;1 NY /T 558---2002f）100%酒精Ⅱ中2h。3.3.1.5放人下列香柏油和二甲苯中透明：a）香柏油中12h;b）二甲苯Ｉ中１h;c）二甲苯中lh。3.3.1.6按下述方法浸蜡：a）软蜡中 40 min;b）硬蜡中 ２h。3.3.1.7将浸好蜡的组织块放人包埋框中用硬蜡包埋，冷却过夜。3.3.1.8将石蜡块切成5μm厚的切片，用干净的载玻片贴片。3.3.2苏木素伊红H-E染色3.3.2.1试剂配制：见附录B。3.3.2.2操作步骤如下：a) 二甲苯 I中 10 min;b)二甲苯Ⅱ中10 min;c)100%酒精1中2min;d)100%酒精Ⅱ中 2 min;e)95%酒精1中2min;f)95%酒精Ⅱ中2min;85%酒精中2 min;g)h)75%酒精中2min;i)自来水洗 2 min;哈里斯酸性苏木精 12 min;j)k)自来水漂洗2min;1) 酸性酒精10 min;m)自来水漂洗5.min;n)饱