激光扫描共聚焦显微GHX.pptVIP

图1. 共聚焦显微镜简化原理图 用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。 当前第30页\共有65页\编于星期五\10点 共轭 当前第31页\共有65页\编于星期五\10点 图2. 探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用） 只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。 当前第32页\共有65页\编于星期五\10点 LSCM扫描图像方式 单一光学切片扫描 (single optical section, x-y) 时程活细胞扫描 (time lapse live cell imaging, x-y-t) 三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z) 四维扫描 (4-D imaging, x-y-z-t) Z X Y XY平面 当前第33页\共有65页\编于星期五\10点 单一光学切片扫描 (single optical section, x-y) Optical sections collected simultaneously at three different excitation wavelengths (488, 568, and 647 nanometers). The specimen is the fruit fly third instar wing imaginal disk. X Y XY平面 当前第34页\共有65页\编于星期五\10点 时程活细胞扫描 (time lapse live cell imaging, x-y-t) X Y XY平面 time Time-lapse imaging of a living fruit fly embryo injected with calcium green is presented in Figure 2. The series of images shows the change in distribution of the fluorescent probe over time. 0 s 10 s 20 s 30 s 当前第35页\共有65页\编于星期五\10点 三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z) Peripheral nervous system of a fruit fly embryo Z X Y XY平面 当前第36页\共有65页\编于星期五\10点 三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z) 当前第37页\共有65页\编于星期五\10点 一种高分辨率的显微成像技术 1 用激光做光源，激光单色性好，光源波长相同，从根本上消除了色差。 2 采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个带有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差，并进一步消除了色差。显微图象的清晰度和细节分辨能力。 3 采用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 当前第38页\共有65页\编于星期五\10点 4 用计算机采集和处理光信号，并利用光电倍增管放大信号，它代替了人眼和照相机进行观察，摄像，得到的图像是数字化的，可以在电脑中进行处理，进一步提高图像的清晰度。 5观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如