层析分离纯化技术策略课件.pptVIP

蛋白层析分离纯化技术1 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括1.分子的大小和形状2.酸碱性质3.溶解度4.吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力。 2 常用测定方法：1. 根据化学组成测定最低相对分子质量2. 凝胶过滤法测定相对分子质量3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量4.渗透压法5.沉降分析法（离心）3 沉淀蛋白质的方法(1) 盐析法(2) 有机溶剂沉淀法(3) 重金属盐沉淀法(4) 加热变性沉淀法4 蛋白质纯化策略融合蛋白质非融合蛋白质表达简单纯化一步 亲和层析90 - 97 % 纯度更高纯度三步纯化策略粗提中度纯化精细纯化多步纯化5 高效纯化策略粗提纯化精细纯化载量速度分辩率回收率6 减少处理步骤得率 (%)95% / 步90% / 步85% / 步80% / 步75% / 步02040608010012345678步骤7 准备工作 考虑:纯度水平需要量保持生物活性有效和经济 蛋白质特性:稳定性- pH- 离子强度- 温度分子量等电点8 pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变滴定曲线蛋白质净电荷 1210稳定性范围用阳离子交换用阴离子交换3pH不同 pH 下的分离情况21+-9 pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变流动相的 pH 选择性VVV阳离子阴离子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面净电荷Abs Abs Abs Abs10 样品准备考虑:根据蛋白质来源选择不同萃取方法使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶在室温以下快速处理用缓冲液维持 pH, 离子强度目的: 稳定样品11 三步纯化策略Step 纯度粗提 中度纯化 精细纯化 样品准备,萃取,净化 达到最高纯度去除大部分杂质 分离, 浓缩和稳定样品12 三步纯化策略步骤粗提精细纯化层析填料的颗粒大小中度纯化13 三步纯化策略步骤粗提精细纯化流速中度纯化14 三步纯化策略步骤粗提精细纯化分辩率中度纯化15 前处理分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。16 样品预处理污染物害处预防措施絮状物堵柱膜过滤、离心、匀浆脂类阻断配基、引致凝集、非特异吸附离心、如可跟目标分子兼容，可用有机溶剂核酸阻断配基、高黏度添加硫酸链霉素、硫酸精蛋白或锰盐沉淀核酸、添加核酸酶蛋白酶分解目标分子添加蛋白酶抑制剂、用亲和层析去除蛋白酶、缩短粗分时间、低温操作17 粗提目的纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶)最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析分辩率快速回收率载量18 粗提: 离子交换填料 预装柱 20ml 颗粒大小 流速HiPrep? 16/10 Q XL SP XL 90 μm 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE CM 90 μm 10 ml/minSepharose? Big BeadsSTREAMLINE?Sepharose? Fast Flow19 粗提: 疏水层析填料高载量高流速HiPrep? 16/10 Phenyl (高 低取代)HiPrep 16/10 ButylHiPrep 16/10 OctylHiTrap?HIC 选择试剂盒放大20 中度纯化目的 去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析HiLoad?离子交换和疏水层析预装柱分辩率快速回收率载量21 中度纯化: 离子交换填料Sepharose? HP 34 μmQ SP150 cm/hr小包装和预装柱 交联琼脂醣SOURCE? 30 μmSepharose High PerformanceSOURCE 30 Q S1 800 cm/hr聚苯乙烯/二乙烯基苯小包装22 中度纯化:疏水层析填料Sepharose? HP 34 μm苯基300 cm/hr小包装和预装柱23 回收率载量精细纯化目的达到最终纯度 (去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术: 凝胶过滤/离子交换 / 疏水层析/反相层析分辩率速度24 精细纯化: 凝胶过滤填料Superdex? PeptideSuperdex 200Superdex 75Mr 3 000 - 70 000Mr 100 - 7 000 Mr 10 000 - 600 000分离分子量大小 (球状蛋白质)102 103 104 105 106用 prep grade