Western-blot转膜整个过程.docxVIP

转膜(Trarsmembran) 1 转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体(例如 NC 膜)上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同， 只 是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者 适用于 大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。 2 转移膜的选择 杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白 的 特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于 Western blot 的 膜主要 有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和 PVDF 膜。 NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持 物，在低离 子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和 力的结合在一 起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转 移的蛋白分子量大 小，选择不同孔径的 NC 膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量 蛋白的结合就越牢固。 通常用 0.45 μm 和 0.2 μm 两种规格的 NC 膜。大于 20 kD 的蛋白可用 0.45 μm 的膜，小于 20 kD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜了，如用 0.45 μm 的膜就会发生 “Blowthrough”的现象。 PVDF 膜 灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合 于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜 在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和 1-5 秒钟。 最常用于 Western Blot 的转移膜主要是硝酸纤维 素(Nitrocellulose, NC)膜和聚偏二氟乙烯 (Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用尼 龙膜、 DEAE 纤维素膜做蛋白印迹。尼 龙膜和 NC 膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜： NC 与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化， 对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在 NC 上的小 分子 蛋白质在洗涤时易丢失； NC 韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF) 膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇 中 浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： p 膜 与 目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量)，以及膜 的孔径(也就是拦截蛋白的大小)； p 不影响后续的显色检测(也就是适和用于所选的显色 方法，信噪比好)； p 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来 挑选不同的转移膜。 背景 蛋白结合能力 机械强度 溶剂抗性 PVDF 膜 低 几种膜的性质对比 NC 膜 低 100-200 μg/cm2 80-100 μg/cm2 强干的膜很脆 强 尼龙膜 较高 400 ug/cm2 软而结实 使用前处理 价格 高 甲醛润湿 缓冲液润湿 较低 缓冲液润湿 3 转膜步骤(以槽式湿转为例) 1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡 10 min 。 注意： 如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白 容易扩散出胶。 2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸 6 片，放入转移缓冲液中平衡 10 min。如用 PVDF 膜需用纯 甲 醇浸泡饱和 3-5 秒钟。(先把 PVDF 膜在甲醇中浸泡约 15s，小于 1min，然后把膜放在 1X 转 膜 缓冲液中浸泡，然后上面铺 2 层滤纸浸泡) 3. 装配转移三明治： 海绵/3 层滤纸/胶/膜/3 层滤纸/海绵，每层放好后， 用试管赶去气泡。 切 记： 胶放于负极面(黑色面 。 4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治(夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面)，(因 为 电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温)，加转移缓冲液，插上电极， 100 V ，1 h (电流 350mA，1h30min)。 注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。 5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。 4 转膜注意事项 1. 泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移 buffer 浸泡 20min； a. 凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转 移 条带变形。 b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。 2. 转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板； 3. 转膜条件： 0.35 A/250 V/1 h/40 min/冰浴中进行转膜