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实用文档 (5) 高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢 机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术 限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生 物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、 基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方 法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术（尤其 是 Roche 454 高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微 生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外 界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生 物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医 疗健康有着重要的理论和现实意义。 在国内， 微生物多样性的研究涉及农业、 土壤、 林业、 海洋、 矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群 落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内 的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群 实用文档 落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现 和检测常见病原及新发传染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方 法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方 法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等 等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的 研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力 量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括 :DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定 量 PCR、基因芯片等。 DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验 结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势 菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中 可能包含不只一种 16S rDNA序列， 因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息， 还需对 每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操作 相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做到 绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微生 实用文档 物多样性的信息， “只能验证已知，却无法探索未知” ，此方 法通过信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的准确。 而近年来以 454 焦磷酸测序为代表的高通量测序技术凭借低 成本、高通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提 供了新的技术平台。 Roche 454 高通量测序技术能同时对样品中的优势物种、稀有物种 及一些未知的物种进行检测，获得样品中的微生物群落组 成，并将其含量进行数字化。最近，美吉生物推出了新的测 序平台——— MiSeq。MiSeq 高通量测序平台集中了 Roche 454 和 Illumina HiSeq 2500 的优点，不仅可实现对多样品的多个可变区同时测序， 而且在测序速度和测序通量上都有进一步提升，目前此平台 已在微生物多样性群落结构研究方面受到了广大学者的认 可。第二代高通量测序技术 产品优势 无需培养分离菌群： 直接从环境样本中扩增核糖体 RNA 高变区进行测序，解决了大部分菌株不可培养的难题。 客观还原菌群结构： 专业、成熟、稳定的样本制备流程，严格控制 PCR 循环数，客观还原样品本身的菌群结构及丰度比例。 实用文档 痕量菌检测： 充分发挥高通量测序的大数据量优势，能检测出丰度低至万 分之一的痕量菌。生信分析 1. 稀释性曲线（ Rarefaction Curve ）采用对测序序列进行 随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表 OTU的数 目构建曲线