叶绿体的分离与荧光观察.pptxVIP

叶绿体的分离与荧光观察;实验目的 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离 的一般原理和方法。;实验原理 ■细胞器分离过程包括两个阶段：破碎细胞和细胞组 分的分离 ■在等渗溶液中进行组织匀浆、分离 叶绿体的分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行 ■叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心 ■利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光;1常用的细胞破碎方法;离心分离技术 ■离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法 不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同 离心力、不同介质中沉降分离。 ■分离各种细胞组分的方法主要有： ＞差速离心 A密度梯度离心 /速率-区带梯度离心 / 等密度离心;差速离心 ■釆用逐渐提高离心速度或低速和高速交替进行离心，使各种沉降系 数不同的颗粒在不同的离心速度及不同的离心时间下分批分离的方 法。 ■操作过程中一般是起始离心速度较低，让沉降系数较大的颗粒沉降 到管底，小的颗粒仍悬浮在上清中。收集上清，改用较高转速离心, 将较小颗粒沉淀。以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 ■方法较简单，但分辨率不高。沉降系数在同一个数量级内的各种粒 子不容易分开。;密度梯度离心 ■用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度 梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重 力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。分 为速率?区带梯度离心和等密度梯度离心。 ■ 一次离心可分离提纯样品中几种组分，用于较精细的 分离。;两种密度梯度离心方法的异同;差速离心与密度梯度离心的区别 ■差速离心是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分 离；密度梯度离心中单一样品组分的分离是借助于混合样品穿 过梯度层的沉降或上浮来达到的； ■差速离心要用两个甚至更多的转速，而密度梯度离心只有一个 离心转速； ■差速离心适用于分离混合样品中各沉降系数差别较大的组分， 而密度梯度离心可分离的物质密度差异较小。 实际操作中，差速离心和密度梯度离心相结合可以达到更精确 的分离。;荧光显微镜观察荧光现象 ■某些物质在一定短波长???光（如紫外光）的照射下吸收光 能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间 内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就 称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。 ■有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为 自发荧光，如叶绿体的火红色荧光。 ■有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也 能发出荧光，这种荧光称为间接荧光，如叶绿体吸附卩丫嚏 橙后可发桔红色荧光。;荧光染料：口丫嚏橙;荧光染料：口丫嚏橙;实验用品 ■材料：新鲜菠菜 ■试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01 %卩丫嚏橙 (acridine orange) ■仪器：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微 镜、烧杯、量筒、滴管、离心管、试管架、纱布、 无荧光载片和盖片等;实验步骤;I注意事项 ■叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35M NaCI)中进行，以免渗透压的改变 使叶绿体受到损伤。 ■分离过程最好在0?5笆的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观 察，控制好离心速度和时间。 ■离心机使用：离心管要平衡 ■弃上清时不要把沉淀荡起，再加NaCI溶液时(少加，以免叶绿体太稀不 易观察)用滴管吹匀混合液，力气不能过大，以免造成叶绿体破碎。 ■荧光显微镜使用 尸荧光显微镜检要在光线尽量喑的环境下进行 ，不要直接观察激发光源，保护眼睛ci— ccm 人荧光染料有一定得毒性，要做好防护 ,观察荧光受多种因素的影响，如温度、光、淬灭剂等 尸在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照 ,制作荧光装片最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油 -汞灯开启后15min内不要关闭;实验结果 ■普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，高倍镜下可看到叶绿体 内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。 ■菠菜叶手切片在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞、保卫细 胞、叶肉细胞。叶肉细胞呈长方形或类方形，内含大量带有绿色的 叶绿体颗粒，后者呈单一或多个排列。另外，视野下还可见到大量 散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。 ■荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体自发荧光为火红色； 卩丫嚏橙染色后间接荧光为橘红色，细胞核呈绿色，气孔仍为绿色。 ■荧光显微镜下，叶肉细胞中叶绿体的荧光强度要比游离叶绿体弱。;;图1普通高倍显微镜下叶绿体;vv.d;c;作业 ■根据显微观察结果，绘制菠菜叶的结构模式图。 ■叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿 体时应注意些什么问题？