小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol.pdfVIP

中国科学院干细胞库细胞培养 Protocol 小鼠胚胎干细胞（ mES 细胞）、小鼠 iPS 细胞培养 Protocol MEF 细胞铺制： 1. 在 T25 培养瓶中加入 0.2 明胶，摇匀后覆盖底面即可， 于 37℃细胞培养箱至 少放置 15 min 以上。 2. 吸除 0.2 明胶，加入事先水浴加热至 37℃的 MEF 完全培养液。一般地，一 个 T25 培养瓶中加入 5 ml MEF 完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF ；小鼠 iPS 使用 ICR-r P3 MEF ，复苏 MEF 细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75 酒精擦拭冻存管旋口 处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含 2 ml MEF 完全培养液的 15 ml 离心管内 ，以 1000 rpm，离心 5 min ，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的 MEF 完全培养 6 液 1 ml，重悬后按照一个 T25 培养瓶铺 1 10 的 MEF 细胞，平均 加入到 T25 培养瓶中，轻 轻摇匀 后置于 37℃细胞培养箱。 24 h 以后可以传入 小鼠胚胎干 细胞或小鼠 iPS 细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠 iPS 细胞前，将 T25 培养瓶中的 MEF 完全 培养液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干细胞、小鼠 iPS 细胞完全 培养液轻轻冲洗 一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠 iPS 细胞完全 培养液 待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠 iPS 细胞冻存管从液氮中取出，置于 37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75 酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防 止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3 4 ml 小鼠胚胎干细胞、小鼠 iPS 细胞完全 培 养液的 15 ml 离心管内 ，以 1000 rpm，离心 5 min 。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠 iPS 细胞完全 培 养液 2 ml ，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至 1 个已经铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠 iPS 细胞完全 培养液。 传代： 1. 一般在复苏后第 2 3 天传代，视克隆大小和密度而定。 2. 吸除废液。 3. 用 PBS （不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。 第 1 页，共 2 页 中国科学院干细胞库细胞培养 Protocol 4. 加入 1.0 ml 的 0.25 胰酶（含 EDTA ）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底 面，置于 37℃培养箱内消化细胞。 5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要 1 2 min ）。 6. 加 2 ml 小鼠胚胎干细胞、小鼠 iPS 细胞完全 培养液终止消化。 7. 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。 8. 加入足量的 小鼠胚胎干细胞、小鼠 iP