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细胞类型特异性转录组学揭示突变的亨廷顿蛋白导致线粒体RNA释放和神经元固有免疫激活 导读 亨廷顿病(HD)是一种由Huntingtin(HTT)基因第1外显子的CAG三核苷酸重复扩增引起的致命神经退行性疾病。在HD中，突变的亨廷顿蛋白（mHTT）导致神经元细胞死亡的机制尚未完全明确。为了探究其中新的分子机制，本文研究人员利用单核RNA测序（snRNA-seq）和翻译核糖体亲和纯化（TRAP）的方法介导了人HD与鼠HD模型尾状核/壳核(纹状体)细胞类型特异性基因表达变化的转录组分析。结果表明，在HD最脆弱的纹状体刺状投射神经元中，研究人员观察到线粒体RNA (mtRNA)(一种强有力的线粒体衍生的天然免疫原)的释放，并同时发现刺状投射神经元中固有免疫信号的上调。此外，研究人员还发现释放的mtRNA能够直接连接固有免疫双链RNA感受器蛋白激酶R(PKR)，仅对线粒体功能的化学抑制(不存在mHTT)足以诱导人神经元PKR的表达。研究人员在本文中强调了考虑细胞类型特异性转录失调在HD发病机制中的重要性，并提出mHTT导致线粒体失调与引起固有抗病毒免疫信号触发的mtRNAs释放，进而导致HD中神经元的脆弱性增强的模型。 实验设计 结果 ?? 为了获取细胞类型特异性基因表达谱，研究人员运用了翻译核糖体亲和层析的方法探究了常用的鼠HD转基因与系列等位基因敲入HD模型。此外，研究人员还利用无偏见的单核RNA-seq探究了鼠常用HD模型与人2-4期HD的细胞类型特异性转录组改变（图1）。 ?? 图1 高密度脂蛋白和高密度脂蛋白小鼠模型的细胞类型特异性纹状体基因表达谱。 （常用的转基因R6/2外显子1 mHTT片段HD模型和等位基因系列敲除蛋白(Q20、Q50、Q111、Q170和zQ175DN) HD模型用于翻译核糖体亲和纯化(TRAP)图谱，该图谱通过免疫亲和纯化遗传确定细胞类型中的GFP标记的核糖体复合物来纯化成熟的细胞质定位的mRNAs。R6/2和zQ175DN模型也用于单核RNA测序(snRNA-seq)，其基于捕获的核序列报告基因表达变化。HD 2-4级患者和对照组尾状核和壳核(纹状体)组织样本也用于snRNA-seq。） ? 1 ?HD小鼠模型细胞类型特异性基因表达分析 ? 为了描述HD中最容易受影响的细胞类型纹状体SPNs，以及与HD相关并提供大量兴奋性谷氨酸输入到纹状体的皮质纹状体投射神经元(CStrPNs)（图2A），研究人员在方法上选择了能在细胞类型群体水平上提供高分辨率并检测成熟mRNA的TRAP方法。模型上，研究人员选择了9月龄经典的HD模型(R6/2)鼠。研究人员先描述了差异基因在三种细胞类型发生的变化以及重叠相似程度。接着描述了差异基因在三种细报富集通路的情况(图2B-E)。最后，研究人员利用权基因共表达网络分析（WGCNA)的方式验证了模块基因共表达情况以及最显著的通路变化富集情况，并利用染色质富集分析(CHeA)进行了验证。 ? 图2 通过TRAP对HD的R6/2模型中纹状体刺状投射神经元(SPNs)和皮质纹状体投射神经元(CStrPNs)进行基因表达变化的细胞类型特异性分析。A：iSPN、dSPN、CStrPNs的示意图 BC；R6/2三种细胞差异基因的数量变化以及相应的独特与重合的韦恩图 D：三种细胞的SPN Marker表达情况 E：R6/2中三种细胞类型的上调与下调的KEGG差异基因富集通路。研究人员发现针对于dSPN和iSPN，上调的差异基因主要富集于突触传导功能下调，上调的差异基因主要富集于DNA错配修复通路。CStrPN与iSPN类似，主要的区别集中在突触传递与昼夜节律传导途径。 ? 2 ?通过TRAP对HD等位基因系列敲入模型的纹状体SPNs、星形胶质细胞和胆碱能中间神经元细胞进行基因表达变化的细胞类型特异性分析 ?? 为了将这些在转基因mHTT外显子1 R6/2模型中获得的数据扩展到HD的全长Htt模型，研究者选取了一系列具有mHTT等位基因的模型（伴随CAG的敲入）并于疾病进展的早期时间点进行检查。所有研究均基于6月，因为6月这个时间点基于全组织RNA测序研究的早期分子表型时间点，方法上研究者选择的是能检测成熟mRNA的TRAP方法。除描述iSPN与dSPN之外，还描述了星形胶质细胞与胆碱能中间神经元，因为星形胶质细胞与HD病理过程相关，而胆碱中间能神经元在HD中代表一群纹状体大量分布（图 3A）。为了鉴定SPN中CAG长度依赖性基因表达的变化，研究者对Q20、Q50、Q111、Q170和zQ175DN模型上述关注细胞类型基因表达变化进行线性回归分析，该分析揭示了数千个基因在dSPN和iSPN中的表达与CAG重复扩展的程度相关，dSPN具有更多的基因取代与ISPN相比，CAG长度依赖性失调。（