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PCR 多聚酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction . 01 原理 以拟扩增的 以一对分别与模板互补的 DNA 分子为模板， 寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，按照 半保留复制的机理沿着模 板链延伸直至完成新的 DNA 合成 . 01 原理 94 温 度 72 （ ℃ ） 高温变性 低温退火 适温延伸 形 成 1 2 3 重复 1~3 步 25~35 轮 目的 DNA 片段 扩增 100 万倍以上 55 条 变 单 性 链 DNA 2 DNA 单链 与引物复性 子链延伸 DNA 加倍 22 DNA 双螺旋 1 2 3 时间（ min ） 4 5 . 02 核酸模板 引物 基本实验步骤 DNA/RNA ，线性，小片段模板，核酸样品应除去存在对 DNA 聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属 离子 PCR 的特异性（ 3 端和 5 端； 18-25bp ； 0.1-0.5 μ M ； Tm 值； 4 种碱基随机分布；自身避免反向重 复序列；引物之间不存在互补序列； 3 端选择保守的氨基酸序列；与非特异性序列的同源性） PCR 的合成原料，四种 dNTP 浓度应相等 4 种 dNTP Taq DNA 聚合酶 耐高温，在热变性时不会被钝化 Mg 2+ 使 DNA 聚合酶具有催化活性 反应缓冲系统 包括 Tris-HCl （维持 PH 值）， KCl （利于引物的退火）， Taq 聚合酶保护剂 . 02 基本实验步骤 实验参数设置 A. 变性的温度与时间 温度取决于 DNA 模板及 PCR 产物的 G+C 含量，时间取决于 DNA 的长度（ 95 ℃ ） B. 退火的温度与时间 温度取决于引物的 G+C 含量及引物的长度，退火时间不是关键因素，但也应该加以控制（ C. 延伸的温度与时间 温度取决于 DNA 聚合酶的最适温度，时间和待扩增片段长度有关（ 72 ℃ ） D. 循环数 PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度（ 30-40 次） . 60 ℃ ） 02 基本实验步骤 PCR 产物检测 琼脂糖凝胶电泳 (1.5%) 加样电泳（电压 80V 、时间 2hr ） EB ，它能和碱基间的氢键结合，在 波长为 254nm~365nm 的紫外光照射下 呈橘红色（ 530nm ）的荧光 . 紫外 琼脂糖凝胶板的制备 03 衍生 PCR 技术 原位 PCR 巢式 PCR PCR 技术 逆转录 PCR 定量 PCR . 多重 PCR 逆转录 PCR 相对于基本 PCR ，在开始阶段增加步骤： RNA → cDNA 合成，是单链到双链的过程。 RNA 水解酶 引物 逆转录酶 . Real Time qPCR 荧光嵌合法 (TB Green ? ) 荧光探针法 实时荧光定量 PCR 技术 (Real-Time Quantitative PCR) 体系中加入荧光基团，利用荧光 是指在 PCR 反应 信号积累实时监测整个 PCR 进程， 最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。 . Real Time qPCR 基线（ Baseline ） 是指在 PCR 扩增反应的最初数个循环 里，荧光信号变化不大，接近一条直线， 这样的直线即基线。 光阈值（ threshold ） 一般将 PCR 反应前 15 个循环的荧光信 号作为荧光本底信号，荧光域值是 PCR 3-15 个循环荧光信号标准差的 10 倍，荧 光域值设定在 PCR 扩增的指数期 Ct (Cycle threshold) 值 表示每个 PCR 反应管内荧光信号到达 。 设定的域值时所经历的循环数 . Real Time qPCR Ct 值无数值（ undetected ） 阴性 Ct 值 ≤30.0 阳性 Ct 值 30.0 表达量极少 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比。 初始 DNA 量越多 , 荧光达到阈值时所需要的循环数 (Ct 值 ) 越少。 起始模板的对数浓度与 Ct 呈线性关系，根据样品的 Ct 值就可计算出样品中所含的模板量。 熔解曲线 确认 PCR 反应的特异性。 .